МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ПОЛИ-ТРЕТ-БУТИЛМЕТАКРИЛАТ КАК НОСИТЕЛЬ ДОКСОРУБИЦИНА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА

Аннотация:

В качестве полимера-носителя доксорубицина для направленного транспорта выбран поли-mреm-бутилметакрилат (ПТБМА). Выбор связан с возможностью гидролиза с образованием водорастворимых полимеров. Использовали реакцию переноса цепи на тио-гликолевую кислоту. Концентрацию тиогликолевой кислоты выбрали равной 1 масс. %, при которой получали полимер с оптимальными биосовместимыми характеристиками (молекулярная масса « 12 кДа, индекс полидисперсности Mw/Mn = 1,5). Проводили химическую модификацию полимера фолатным вектором. Полученный полимер превращали кислотным гидролизом в водорастворимый сополимер. Затем получили конъюгат доксорубицина (DOX) с сополимером mреm-бутилметакрилата — сополимером mреm-бутил-метакрилата - метакриловой кислоты, модифицированный фолатным вектором по карбоксильным концевым группам. Степень связывания с полимерным DOX составляла (62,7±11,8)%. Выделение DOX из полимерной системы происходит почти в 3 раза быстрее при рН 4,6, чем при рН 7,4. Цитотоксичность полимерного конъюгата составляла 1,52 мкМ. Ключевые слова: полимерный носитель; конъюгат доксорубицина; фолатный вектор. В последние десятилетия активно разрабатываются новые способы противоопухолевой терапии. Одной из перспективных разработок в этой области являются транспортные системы селективной доставки лекарственных средств. Одним из перспективных способов создания таких лекарственных средств является конструирование полимерных систем, содержащих "узнающие" компоненты (векторы). Целью данной работы явилось получение и изучение физико-химических и цитотоксических свойств модифицированного полимерного конъюгата доксорубицина на основе поли-mpem-бутилметакрилата (ПТБМА) для направленного транспорта. Экспериментальная часть Для синтеза полимерного носителя использовали следующие реагенты: mpem-бутилметакрилат (ТБМА) в качестве мономера (98%, Aldrich); фолиевая кислота (ФК) (97%, Fluka); N-гидроксисукцинимид (NHS) (98%, Fluka); дициклогексилкарбодиимид (ДЦГК) (98%, Alfa Aeser); доксорубицина гидрохлорид (DOX) (Teva); тиогликолевая кислота (ТГК); гексаметилен-диамин (ГМДА); гидразингидрат и динитрил азо-изо-масляной кислоты (ДАК) в качестве инициатора радикальной полимеризации. ПТБМА. Для получения носителя доксорубицина использовали метод радикальной полимеризации ТБМА в массе при 70°С в присутствии 5 • 10 в -2степени М ДАК и ТГК в качестве передатчика цепи. Полученный полимер очищали трехкратным переосаждением из ацетона в воду, а затем сушили в вакууме до постоянной массы. Кинетику полимеризации ТБМА изучали дилатометрическим методом, основанном на эффекте уменьшения объёма системы в ходе процесса. Молекулярно-массовые характеристики полимеров определяли методом гель-проникающей хроматографии в ТГФ при 40°С по полиметилметакрилатным стандартам на жидкостном хроматографе Prominence LC-20VP "Shimadzu", оборудованном 2 колонками, наполненными стирагелем с размером пор 106 и 105 А, и дифференциальным рефрактометром. Гидролиз ПТБМА проводили в среде диоксана в присутствии разбавленной НС1 (1:2) из расчета 0,5 мл на 0,25 г полимера при температурах 60, 80 и 100°С в колбе с обратным холодильником. Содержание звеньев метакриловой кислоты (МАК) определяли потенцио-метрическим кислотно-основным титрованием в смеси метанола с ТГФ 0,1 н. раствором КОН в метаноле. Синтез фолатного вектора (ФВ) проводили карбодиимидным методом согласно описанной методике Регистрацию ИК-спектров исследуемых соединений проводили на ИК Фурье-спектрометре ФСМ 1201 (ООО Мониторинг, Санкт-Петербург) в спектральном диапазоне от 400 до 4000 см-1 число сканов 32; окна КВг. Образцы готовили в виде суспензии в вазелиновом масле. Модификация полимера ФВ по концевым группам ПТБМА проводилась в 2 последовательные стадии: реакция получения NHS-производного (полимер А) и химическая реакция взаимодействия между полимером А и ФВ (продукт — полимер Б). Полимер А получали добавлением к раствору ПТБМА (Мп=12800, Mw/Mn=1,35) в ТГФ с концентрацией 0,02 г/мл, ДЦГК и NHS в мольном соотношении ПТБМА — ДЦГК — NHS = 1:1,5:1,5 и выдерживанием смеси в холодильнике в течение не менее 12 ч. Полимер Б получали при взаимодействии раствора полимера А в ТГФ с растворенным в диметилсульфоксиде (ДМСО) ФВ в эквимолярном соотношении при комнатной температуре. Через 12 ч из раствора осаждением в воду выделяли полимер Б. Синтез полимерного производного DOX проводили согласно методике следующим образом. УФ-спектры растворов сополимеров в ДМСО с концентрацией 4х10 в -7степни г/мл записывали на УФ-спектрометре Shimadzu UV 1650 DC (рабочий спектральный диапазон 190-1100нм, погрешность установки длины волны 0,3 нм). Спектры ядерного магнитного резонанса ('Н ЯМР) регистрировали на спектрометре Bruker FT-80-спектрометре (Bruker). Прибор работает на частоте 400 МГц; химические сдвиги (сигма) регистрировали относительно внутреннего стандарта тетраметилсилана. С этой целью CDC13 использовали в качестве растворителя для ПТБМА, в то время как DOX, сополимер ТБМА — МАК, конъюгат сополимера с DOX, растворяли в (d6) ДМСО. Элементный анализ осуществляли с использованием элементного анализатора Vario EL Cube для одновременного определения С, Н, N, S. Степень прививки DOX к сополимеру. Степень присоединения DOX к сополимеру ТБМА — МАК — ФВ определяли фотометрически на приборе UVmini-1240 Shimadzu. Для этого получали калибровочный график зависимости оптической плотности растворов DOX (2 мг/мл) от концентрации при X = 490 нм. Затем по величине оптической плотности исследуемого раствора (надосадочной жидкости) и калибровочному графику находили искомую концентрацию DOX, не вступившего в реакцию. Степень прививки DOX к полимеру рассчитывали по формуле: формула, где Р — степень прививки DOX, %; т0 — масса всего DOX, мг; тх — масса несвязанного DOX, мг. Степень высвобождения DOX из полимерного носителя in vitro. Определение степени высвобождения DOX проводили в буферном растворе при рН = 4,8 и 7,4 в диализаторе, ячейки которого разделены мембраной CelluSep Tl, MW 3500 Да. Полимерный конъюгат растворяли в буферном растворе (2 мг/мл) и помещали в один из отсеков диализатора. В другой отсек помещали соответствующий буферный раствор. После этого диализатор помещали в термостат при 37°С. Через определенные промежутки времени из отсека с буферным раствором отбирали пробу для определения содержания свободного DOX (все содержимое отсека) и заполняли свежим раствором. Цитотоксичность полученных систем. В работе использовали клеточную линию колоректального рака человека НСТ116. Цитотоксическое действие DOX исследовали с помощью МТТ-теста, основанного на способности митохондриальных дегидрогеназ в жизнеспособных клетках восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Измерение концентрации формазана в растворе после взаимодействия с ДМСО позволяет определить количество жизнеспособных клеток, а в цитотоксических исследованиях оценить специфическую гибель клеток, индуцированную тем или иным агентом. Клетки НСТ116 высевали на 96-луночный планшет в количестве 2000 клеток на 1 лунку в 200 мкл среды DMEM ("ПанЭко", Россия), содержащей 2 мМ глутамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10 % FBS (HyClone, США), затем помещали в инкубатор на 24 ч (37°С, 5% С02). Через 1 сут исходную среду заменяли на полную среду DMEM с DOX. Концентрация варьировала от 0,005 до 200 мкМ. Через 48 ч производили смену среды на питательную среду с МТТ (0,5 мг/мл) по 100 мкл на лунку. Планшет помещали в СО2-инкубатор на 1 ч, после чего среду отбирали и в каждую лунку прибавляли по 100 мкл раствора ДМСО. Затем измеряли оптическую плотность полученного раствора формазана в ДМСО на планшетном спектрофотометре SynergyMX (BioTek, США) при длине волны 570 нм. За 100% выживаемость принимали интенсивность окраски в контрольных лунках с клетками, не обработанными DOX и его производными. Для исследования ответа клеток на воздействие была выбрана концентрация препарата, при которой за 48 ч жизнеспособность теряют 50% клеток (IС50). Результаты и их обсуждение: Выбор в качестве полимерного носителя ПТБМА обусловлен возможностью его гидролиза в относительно "мягких" условиях с образованием водорастворимых биосовместимых сополимеров ТБМА — МАК либо ПМАК. Поскольку молекулярная масса (ММ) не-биодеградируемых полимеров не должна превышать значений почечного порога (Мn < 30000), для регулирования этого параметра мы использовали реакцию передачи цепи на ТГК, которая позволила не только регулировать ММ, но и функционализировать макромолекулы полимера карбоксильными группами, наличие которых делает полимер пригодным для дальнейшей модификации ФК. Для получения полимера с заданными характеристиками изучено влияние концентрации ТГК как на начальную скорость полимеризации ТБМА, так и на ММ полимера. Скорость полимеризации ТБМА снижается в 1,5 раза уже при введении 0,5% ТГК и далее практически не зависит от концентрации передатчика цепи. Уменьшение скорости полимеризации связано с тем, что радикал HOOCCH2S', образующийся по реакции передачи цепи, более стабилизирован, а, следовательно, менее активен, чем радикал ТБМА. В ходе исследования определена оптимальная концентрация ТГК, которая составила 1%. При данной концентрации за 4 ч достигается конверсия ~ 98%, и образуется ПТБМА с оптимальными для биосовместимых полимеров характеристиками: Мn = 12400 и Mw|Mn = 1,35. Для оценки степени функционализации этого полимера концевыми карбоксильными группами был применен простой теоретический расчет при допущении, что константа передачи цепи не меняется в течение всего процесса полимеризации. Суть его состоит в следующем. Исходя из пропорции расхода 1 моль ТГК на х моль ТБМА, а [S]0-[S] моль ТГК — на моль ТБМА, получаем: х=- [М]/([S]0-[S]), в частности, для конверсии 98 % х=0,98[МУ([S]0-[S]). Неизвестная в этом соотношении концентрация передатчика цепи [S] при данной конверсии может быть рассчитана из уравнения: При заданных значениях [М]0 и [S]0, (полимеризация ТБМА в массе, 1% ТГК) с помощью уравнения (2) получаем, что х=70 моль ТБМА. Это означает, что на каждые 70 звеньев ТБМА приходится один остаток ТГК. В нашем случае при Мn = 12400 каждая макромолекула содержит 12400:142 = 87 звеньев ТБМА, т.е. можно считать, что практически все макромолекулы ПТБМА функционализированы карбоксильными звеньями. Данные расчеты подтверждаются результатами элементного анализа, содержание S составило (0,28±0,05)%. Данный результат согласуется с теоретическим содержанием серы 0,26%. Теоретическое содержание серы в образце ПТБМА рассчитывали как отношение атомной массы элемента к средней молекулярной массе полимера: формула. Наличие свободной карбоксильной группы было использовано для модификации полимера ФК, которая является вектором к опухолевым клеткам. Для этого карбодиимидным методом карбоксильные группы ПТБМА были превращены в гидроксисукцинимидные (полимер А), а из ФК получен ФВ — гексаметилен-диамин фолат по реакциям взаимодействия ФК с NHS, ДЦГК и ГМДА. Доказательством образования последнего являются данные ИК-Фурье спектроскопии (рис. 1). Видно, что в спектре гексаметилендиамин фолата имеются полосы, отвечающие валентным колебаниям метиленовых групп молекулы ГМДА в области 2854 и 2936 см-которых нет в спектре ФК. Для ФВ, как и для ФК, характерен выраженный пик при X=289 нм (рис. 2). Затем полимер А превращали в полимер Б — ПТБМА с концевыми группами ФК (схема 1). Изучена кинетика кислотного гидролиза ПТБМА для получения биосовместимого полимера, содержащего звенья МАК. Как видно из схемы 2, гидролиз ПТБМА носит автокаталитический характер и является необратимым процессом по причине выделения газообразного изобутилена. Для оценки энергии активации этого процесса проведены исследования при 60, 80 и 100°С. На основании одного из основных уравнений химической кинетики, уравнения Аррениуса, определяющего зависимость скорости реакции от температуры было рассчитано значение энергии активации кислотного гидролиза ПТБМА Еn = (9,34±0,08) кДж/моль (рис. 3). Такая низкая величина Е,л может указывать на диффузионный контроль процесса. Увеличить скорость реакции возможно перемешиванием среды, снижая диффузионные затруднения. Подтверждением наличия в сополимере концевого остатка в виде ФВ, не разрушающегося в результате гидролиза, являются данные ЯМР-спектроскопии. В ЯМР-спектре модифицированного ФВ сополимера появляются пики при 1,23; 1,26 м.д., которые наблюдаются в ЯМР-спектре ФВ и отсутствуют в спектре "чистого" сополимера. В спектре ФВ регистрируются пики при 2,36, 2,39 и 2,40 м.д., а также при — 7,12; 7,22; 7,34 м.д., которые имеют место и в спектре модифицированного сополимера (2,38; 2,39; 2,41 и 7,02; 7,15; 7,28 м.д. соответственно). Полученный сополимер ТБМА — МАК (20:80 масс. %) использован в качестве носителя для противоопухолевого средства DOX. Для этого проводили химическую "прививку" по реакции карбоксильных групп, предварительно модифицированных гидразином, получая полимерный конъюгат DOX. Аналогично получен конъюгат DOX с сополимером ТБМА — МАК, модифицированным ФВ по концевым карбоксильным группам (схема 3). Свидетельством образования конъюгата, имеющего в своем составе ФВ и DOX, являются данные УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопии. Согласно результатам УФ-спектроскопии, в полимерном конъюгате (ТБМА — МАК) — DOX — ФВ появляется выраженный пик при X = 289 нм, который характерен для ФК и ФВ. Этот пик отсутствует в спектрах соединений, не имеющих в своем составе ФВ (таблица). Смещение длины волны максимума пика полимерного производного DOX объясняется образованием гидразоновой связи между гидразидом полимерного производного и тетрациклического антрахиноидного агликона DOX. Также подтверждением образования конъюгата сополимера ТБМА — МАК — ФВ с DOX являются данные ЯМР-спектроскопии (рис. 4). Кривая ЯМР-спектра конъюгата в области 3,35 - 3,62 повторяет ЯМР-спектр DOX. Степень привязки DOX к полимерному носителю составила (62,7 ± 11,8)%. Исследования по определению степени высвобождения DOX из полимерного носителя в условиях, имитирующих биосреду, показали, что высвобождение лекарственного вещества происходит быстрее почти в 3 раза при рН = 4,6 нежели при рН = 7,4 (рис. 5). Цитотоксическое действие конъюгата оценено на клеточной линии колоректального рака человека НСТ116 с помощью МТТ-теста. "Чистый" DOX использовался в качестве контроля. Уровень устойчивости клеток определяли по концентрации DOX, при которой наблюдается гибель 50% клеток (IC50DOX = 0,12 мкМ; IС50 ТБМА-МАК-фb-dох= 1,52мкМ (в эквиваленте к DOX) (рис. 6). Цитотоксичность конъюгата была ниже по сравнению с "чистым" DOX. Об этом сообщалось и ранее для других полимерных конъюгатов DOX. Данное обстоятельство связано с низкой скоростью поглощения (эндоцитоз) полимерного конъюгата по сравнению со свободным лекарственным средством, которое способно диффундировать через мембрану вследствие своей малой ММ. Также определенное время необходимо для эндосомальной/лизосомальной активации полимерного носителя, которая заключается в гидролизе гидразоновой связи в кислой среде и выделении свободного DOX. В исследовании использованы данные, полученные на оборудовании центра коллективного пользования "Аналитический центр ИМХ РАН" (Нижний Новгород).

Авторы:

Издание: Химико-фармацевтический журнал
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 6.-С.38-43. Библ. 12 назв.
Просмотров: 54