МЕТОДЫ АНАЛИТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ТАБЛЕТИРОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ДАРУНАВИРА. СООБЩЕНИЕ II

Аннотация:

Ранее показано, что целенаправленная разработка специальных методик, регламентирующих методы аналитического контроля лекарственных форм дарунавира (ДРВ), позволяет избежать использования дорогостоящих импортных стандартных образцов (СО). В сообщении I описаны такие методики и результаты их валидации. Предназначались они для разделов "Подлинность", "Тальк, кремния диоксид, титана двуокись" и "Растворение" соответствующих монографий. В сообщении II продолжено рассмотрение методик, не требующих использования СО, предлагаемых для включения в разделы монографий "Посторонние примеси" и "Количественное определение". Оценку содержания посторонних примесей предложено проводить методом ВЭЖХ в градиентном режиме. Нижний предел определяемого содержания отдельной примеси по отношению к ДРВ равен 0,02%, относительное стандартное отклонение (RSD) суммарного содержания примесей не превышает 10%. В разделе "Количественное определение" концентрацию ДРВ предложено определять методом прямой УФ-спектрофотометрии в растворе аналита (рН ~ 9) по методике, применение которой потребовало предварительного экспериментального определения величины удельного показателя поглощения ДРВ (А1%1см) в водно-метанольных растворах (рН ~ 9) в максимуме при длине волны 267 нм. Найденное значение А1%1см = 393,4 см-1 (RSD < 1% при степени надёжности а=0,05). Следовательно, величина А1%1см является физико-химической константой. Её использование обеспечивает при количественных определениях ДРВ методом прямой УФ-спектрофотометрии снижение RSD результатов до 1% и сокращение затрат времени в 2-3 раза ввиду отсутствия необходимости приготовления растворов стандартного образца и измерения их оптической плотности. Ключевые слова: монография; дарунавир (ДРВ); ДРВ этанолят; ДРВ аморфный; стандартный образец (СО); метод ГЖХ; примеси; удельный показатель поглощения (А1%1см); активная фармацевтическая субстанция (АФС); УФ-спектрофотометрия; валидация. Одним из лучших фармакоэкономически эффективных ингибиторов ВИЧ протеазы является [(3R,3aS,6aR )-гексагидрофуро[2,3-b]фуран-3-ил]-N-[(1S,2R)-3-[[(4-аминофенил)сульфонил](изобутил)амино]-1-бензил-2-гидроксипропил]карбамат, получивший МНН "Дарунавир" (ДРВ). ДРВ содержится в таблетках KEMERUVIR в форме несольватированного аморфного вещества, а в таблетках PREZISTA — в форме кристаллического этанолята. Эмпирическая формула ДРВ этанолята -C27H37N307S • С2Н5ОН; молек. масса ДРВ этанолята -593,7. В работе показано, что целенаправленная разработка специальных методик для включения их в разделы монографий, регламентирующих методы контроля качества лекарственных форм ДРВ, позволяет исключить использование дорогостоящих стандартных образцов (СО). При этом были разработаны методики, предназначенные для включения в разделы "Подлинность", "Тальк, кремния диоксид, титана двуокись" и "Растворение". В настоящем сообщении представлены методики, предназначенные для включения в разделы "Посторонние примеси" и "Количественное определение". Они также не требуют использования СО и, с учётом своих валидационных характеристик, пригодны для включения в монографии, регламентирующие контроль качества лекарственных форм, содержащих ДРВ в качестве активной фармацевтической субстанции (АФС). Раздел "Посторонние примеси". Определение содержания примесей проводят методом ВЭЖХ. На основании результатов валидации в монографию введена следующая методика: Колонка Xbridge С18 3,5 мкм 4,6 х 150 мм Температура колонки 40°С Расход подвижной фазы (ПФ) 1,3 мл/мин СФ детектор X 264 нм Программа "время — состав ПФ" представлена в табл. 1. Компонент А ПФ. Помещают 0,77 г аммония ацетата в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют 600 мл воды, перемешивают до растворения. Под потенциометрическим контролем при перемешивании доводят рН полученного раствора до 9,6 добавлением 25 - 30 капель раствора аммиака концентрированного 25%. Объём раствора в колбе доводят водой до метки, перемешивают и фильтруют через стеклянный фильтр №3, затем дегазируют (срок годности компонента А ПФ — 1 сут). Компонент В ПФ. Ацетонитрил для хроматографии. Бланк-раствор. В коническую колбу с притёртой пробкой вместимостью 250 мл вносят по 100 мл компонентов А и В ПФ, перемешивают (срок годности бланк-раствора — 1 сут). Испытуемый раствор. Помещают 50 мг порошка растёртых таблеток в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 12,5 мл ацетонитрила (т.е. компонента В ПФ), полученную суспензию обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин и после охлаждения до комнатной температуры доводят её объём до метки компонентом А ПФ, перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (первые 2 мл фильтрата отбрасывают). Фильтрат используют в качестве испытуемого раствора (срок годности — 8 ч). Примечание. Навеска рассчитана в предположении, что 1 г таблеточной массы содержит ~ 0,50 г ДРВ. Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. Помещают 1 мл испытуемого раствора в коническую колбу с притёртой пробкой вместимостью 10 мл, прибавляют 4 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты, перемешивают. Кислый раствор выдерживают 30 мин при температуре от 95 до 100°С, охлаждают до комнатной температуры и прибавляют к нему 4 мл 1 М раствора натрия гидроксида, перемешивают (срок годности раствора для проверки пригодности хроматографической системы — 8 ч). Примечание. В указанных условиях частично проходит гидролиз ДРВ с образованием эквимолекулярных количеств сульфаниловой кислоты и [(3R,3aS,6aR)-гексагидрофуро[2,3-b]фуран-3-ил]-N[-[(1S,2R)-3-[(изобутил)амино]-1-бензил-2-гидроксипропил]карбамата. Оба продукта имеют фенильный хромофор, следовательно, можно считать, что сумма их молярных показателей поглощения должна быть равна молярному показателю поглощения ДРВ. Экспериментально показано, что в пересчёте на равные количества хроматографируемых веществ площадь единственного пика ДРВ (S) на рис. 1, б и сумма площадей 3 пиков (LS) на рис. 2 отличаются от их среднего значения (S + ЕS)/2 не более чем на 5%. Раствор сравнения. Помещают 1 мл испытуемого раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объём раствора до метки бланк-раствором, перемешивают. Полученный раствор в объеме 1 мл помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора до метки бланк-раствором, перемешивают (срок годности раствора сравнения — 8 ч). Порядок хроматографирования. Хроматографическую колонку кондиционируют не менее 10 мин (расход ПФ 1,3 мл/мин при объёмном отношении компонентов ПФА и В 9:1). Последовательно хроматографируют (по 20 мкл) бланк-раствор (не менее 1 раза), раствор для проверки пригодности хроматографической системы (не менее 1 раза), раствор сравнения (не менее 2 раз), испытуемый раствор (не менее 3 раз). Типичные хроматограммы представлены на рис. 1 и 2. Хроматографическая система считается пригодной, если: на хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы (рис. 2) величина разрешения между пиком ДРВ (основной пик) и ближайшим к нему пиком продукта разложения > 2; на хроматограмме испытуемого раствора величина хвостового фактора пика ДРВ (основной пик) не превышает 1,7; эффективность колонки по пику ДРВ не меньше 5000 теоретических тарелок; отношение площадей пиков ДРВ на хроматограммах испытуемого раствора к площадям его пиков на хроматограммах соответствующих растворов сравнения находится в пределах от 800 до 1200. В случае необходимости допускается корректировка условий хроматографирования в целях достижения пригодности хроматографической системы. Расчет. Содержание любой примеси в препарате (Xt) в отн. % от содержания в нём ДРВ вычисляют по формул: формула, где Si — площадь пика i-той примеси на хроматограмме испытуемого раствора; So — площадь пика ДРВ на хроматограмме раствора сравнения. Пики примесей, для которых величина Xt < 0,02%, при расчёте суммарного содержания примесей не учитываются. Содержание любой единичной примеси в препарате в отн. % к ДРВ не должно превышать 0,2%, при этом их суммарное содержание в препарате (ЕХ1) не должно превышать 0,5%. Результаты испытания считаются достоверными, если хроматографическая система признана пригодной к использованию. Валидация. Методика определения посторонних примесей в таблетках, содержащих ДРВ в качестве АФС, была экспериментально валидирована по следующим характеристикам: предел обнаружения (чувствительность); предел количественного определения; аналитическая область; линейность; правильность; прецизионность (повторяемость, иначе сходимость; промежуточная прецизионность). Использовались жидкостные хроматографы Alliance (Waters, США) и Agilent 1200 (Agilent Technologies, США). Предел обнаружения (чувствительность). В соответствии с приведенной выше методикой для приготовления раствора сравнения испытуемый раствор разбавляют в 1000 раз. Следовательно, площадь основного пика на хроматограмме этого раствора должна составлять ~ 0,1% от площади пика ДРВ на хроматограмме испытуемого раствора (рис. 1, хроматограммы а и б). При этом экспериментально показано, что на хроматограммах испытуемого раствора могут фиксироваться пики, по площади составляющие ~ 0,01 % от площади основного пика. Мы рассматриваем эту величину как предел обнаружения содержания примесей по предложенной методике, что и является критерием приемлемости последней по характеристике "Предел обнаружения (чувствительность)". Пределы количественного определения. С учётом изложенного нижний предел количественной оценки содержания отдельной примеси принимается равным 0,02%. При этом верхний предел определения содержания отдельной примеси мы формально принимаем равным 1%. Реально верхний предел не следует ограничивать, поскольку, как указано выше, содержание любой единичной примеси в препарате в отн. % к ДРВ не должно превышать 0,2%. В принципе, при наличии экспериментальных данных о пригодности валидируе-мой методики для надёжного определения содержания отдельных примесей, лежащего как ниже, так и выше допущенной для каждой из них нормы, определять пределы обнаружения нет необходимости. Аналитическая область. В данном случае аналитическая область методики для отдельной примеси лежит выше 0,02% от хроматографируемого количества ДРВ, равного ~ 20 мкг, что полностью удовлетворяет требованиям к критериям пригодности методики по характеристике валидации "Пределы количественного определения". Линейность и правильность. Подтверждением того, что по характеристикам "Линейность" и "Правильность" методика удовлетворяет необходимым требованиям, служит близкая к 1000 (т.е. к степени разбавления) величина отношения (J) площадей пиков ДРВ на хроматограммах испытуемого раствора к площадям его пиков на хроматограммах соответствующих растворов сравнения. При этом уравнение графика зависимости площади пика (5) от массы ДРВ в заколе (т, мкг) является линейным. При обработке методом наименьших квадратов (МНК) данных хроматограмм, представленных на рис. 1, б и 2, вычислено: S= 1366268m + 3007, R = 1,0000 (абсциссы в мкг: m1 = 0; m2 = 0,0192; m3 = 19,2). Абсолютную величину стандартного отклонения величины j от 1000 при этом можно рассматривать как критерий соответствия валидируемой методики требованиям характеристик "Линейность" и "Правильность". Для величины j должно быть справедливо неравенство: | j- 1000|- 100 %/1000 < 20%. Для 10 параллельных определений величина | j - 1000| • 100%/ 1000 не превышала 20%. Например, для хроматограмм а и б (рис. 1) j = 26235349/32250 = 813,4, |813,4 - 1000| х 100%/1000 = 18,7%, т.е. < 20%. Если же вычислять S2 по уравнению S= 1366268m + 3007 при m2 = 0,0192, то j = 26235349/29239 = 897,3, и тогда получим: |897,3 - 1000| • 100%/1000 = 10%. Таким образом, по характеристикам "Линейность" и "Правильность" методика пригодна для включения в монографии. Прецизионность. Применительно к валидируемой методике эту характеристику надлежит оценивать на 2 уровнях: - как повторяемость (сходимость); - как промежуточную прецизионность. Повторяемость (сходимость) характеризует прецизионность аналитической методики при одинаковых условиях испытания в отдельно взятой лаборатории в пределах краткого промежутка времени (один и тот же исполнитель, одно и то же оборудование, один и тот же набор реактивов). Промежуточная прецизионность характеризует влияние на прецизионность аналитической методики факторов варьирования условий (разные дни проведения испытаний, исполнители, приборы). Исследование влияния перечисленных факторов может проводиться одновременно. Валидируемая методика предписывает регулярную проверку пригодности хроматографической системы перед началом работы. В процессе валидации критерием пригодности по характеристике "Прецизионность" является величина относительного стандартного отклонения (RSD) площадей пиков ДРВ на хроматограммах растворов сравнения. Усреднённое значение этой величины не должно превышать 10%. Первый эксперимент проводился параллельно 2 исполнителями на протяжении 5 рабочих дней с использованием растворов сравнения, приготовленных из препарата 3 различных серий. Получены данные для оценки промежуточной прецизионности, приведенные в табл. 2. На основании приведенных данных валидируемая методика может быть включена в монографию, поскольку выполнение неравенства RSD < 10% для площадей пиков ДРВ на хроматограммах растворов сравнения подтвердил эксперимент. При реально найденном значения этого критерия (RSD < 5%) содержание отдельной примеси, равное ~ 0,2%, может определяться с RSD < 2,5%, а равное -0,05% — с RSD <10%, если считать уровень "шума", не превышающим 3% от стандартного отклонения площади пика на хроматограммах раствора сравнения, полученных при проверке пригодности хроматографической системы. Во втором эксперименте для одной серии таблеток ДРВ (0,5 г ДРВ в 1 г таблеточной массы) проведено 5 параллельных определений примесей. Найденные величины Хг отвечающие условию Х: < 0,02 %, приведены в табл. 3. Для суммарного содержания примесей 2LY, в данном случае в качестве критерия пригодности методики принято условие: RSD ЪХ1 не должно превышать 10 %. Следовательно, методика определения примесей удовлетворяет необходимым требованиям по характеристике "Прецизионность" в целом и может быть включена в монографию. Раздел "Количественное определение". Для количественного определения ДРВ или ДРВ этанолата в препарате предложено использовать метод УФ-спектрофотометрии. Данные представляют в пересчёте на ДРВ. На основании результатов валидации методика может быть введена в монографию в редакции: Раствор сравнения. 25 мл буферного раствора рН 9,0 (1) (ГФ XIII, т. I, ОФС.1.3.0003.15, с. 1450) помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, прибавляют 400 мл метанола и перемешивают. После охлаждения до комнатной температуры объём раствора доводят метанолом до метки, перемешивают (срок годности раствора сравнения 7 сут). Испытуемый раствор. Около 0,15 г (точная навеска) порошка таблеток, растёртых в агатовой ступке, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 70 мл раствора сравнения, полученную суспензию обрабатывают ультразвуком (5 мин), охлаждают до комнатной температуры, доводят её объём раствором сравнения до метки, перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Первую порцию фильтрата 10 мл) отбрасывают. 2 мл полученного фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объём раствора раствором сравнения до метки, перемешивают (срок годности испытуемого раствора — 6 ч). Измерения. Оптическую плотность испытуемого раствора измеряют на спектрофотометре относительно раствора сравнения в максимуме поглощения при длине волны (267±2) нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Содержание C27H37N307S • С2Н5ОН (ДРВ этанолата) в таблетке в миллиграммах (X) в пересчёте на C27H37N307S (ДРВ) и среднюю массу таблетки вычисляют по формуле: где А — оптическая плотность испытуемого раствора; А1%1см - удельный показатель поглощения раствора дарунавира в среде раствора сравнения с рН ~ 9 (А1%1см=392,6 см-1); а — навеска порошка растёртых таблеток, г; mс — средняя масса таблетки, г. Содержание C27H37N307S • С2Н5ОН (ДРВ этанолата) в таблетке (X, мг) в пересчёте на C27H37N307S (ДРВ) и среднюю массу таблетки должно быть в пределах ± 5% от номинального. Валидация. Приведенная методика валидировалась по следующим характеристикам: специфичность; аналитическая область; линейность; правильность; прецизионность. Использование приведенной выше методики и её валидация требовали точного предварительного определения удельного показателя поглощения ДРВ, растворённого в среде, величина рН которой не допускает его протонирования. В такой среде при выбранной длине волны величина удельного показателя поглощения максимальна, даже если батохромный сдвиг рабочего максимума поглощения не наблюдается. Работа по определению величины удельного показателя поглощения растворов ДРВ проводилась по той же схеме, что и при её определении для растворов ДРВ в среде растворения. Полученные в эксперименте данные представлены в табл. 4 и на рис. 3. Специфичность. Методика валидировалась по этой характеристике в разделе "Подлинность" (рис. 1). Было найдено, что присутствие вспомогательных веществ не изменяет характер УФ-спектра раствора препарата в сравнении с УФ-спектром раствора АФС ДРВ этанолята, что является критерием пригодности методики по характеристике "Специфичность". Аналитическая область, линейность, правильность, прецизионность На рис. 3 приведен график линейной зависимости оптической плотности (А) растворов с известной концентрацией ДРВ (с, г/100 мл) в среде раствора сравнения с рН ~ 9. При этом с использованием МНК в соответствии с табл. 4 найдено: А1%1см = 392,58 (рис. 3). Табл. 3 и построенный на её основе график (рис. 3) обобщают результаты, полученные на протяжении 6 мес 4 разными исполнителями при работе на 2 разных спектрофотометрах, Carry 50 Scan UV-VIS (США) и Adgilent 8453 UV-VIS (США), с использованием для приготовления модельных растворов 7 образцов ДРВ этанолята, полученных из 5 источников. Для точного расчёта концентрации спектрофотомерируемых растворов содержание ДРВ во всех образцах ДРВ этанолята предварительно определялось их титрованием по первичной ароматической аминогруппе, как указано в разделе "Растворение". С учётом всех полученных данных значение углового коэффициента линейной зависимости А =А1%1см х х + b методом МНК было найдено равным 392,59 см4, её свободный член b статистически достоверно не отличался от нуля, коэффициент корреляции R равен 0,99955, а доверительный интервал дельтаA1%1см лежал в пределах ± 2,4 см-1 (±0,6% относительных) при степени надёжности а, равной 0,05. Концентрация ДРВ в испытуемом растворе должна быть =0,00192%. Оптическая плотность такого раствора равна и 0,755. Таким образом, с учётом подтверждённой специфичности методики (рис. 1) её пригодность по характеристикам аналитическая область (графы 1, 2 табл. 3), правильность, прецизионность (графа 3 табл. 3) доказана. Методика может быть включена в монографии на препараты, содержащие ДРВ и ДРВ этанолят в качестве АФС. На основании изложенного включение предлагаемых методик в монографии, регламентирующие качество содержащих ДРВ препаратов, позволяет полностью исключить необходимость использования СО при анализе таких препаратов. В разделе "Посторонние примеси" для оценки чистоты препаратов ДРВ предложено использовать метод ВЭЖХ. Проверку пригодности хроматографической системы проводят по величине разрешения между пиком ДРВ (основной пик) и ближайшим к нему пиком продукта гидролиза на хроматограммах раствора для проверки пригодности хроматографической системы. Эта величина должна быть > 2. Указанный раствор и раствор сравнения готовят непосредственно из испытуемого раствора, что исключает необходимость использования СО. Метод валидирован. В разделе "Подлинность" предложено использовать спектрофотометрическое подтверждение наличия ДРВ в препарате. В разделах "Растворение" и "Количественное определение" также применён спектрофотометрический метод — при вычислении концентраций испытуемых растворов соответственно использованы разные значения удельных показателей поглощения ДРВ: А1%1см = 359,6 и A1%1см = 392,6. Они соответствуют величинам рН испытуемых растворов в тесте "Растворение" рН = 3, в тестах "Подлинность" и "Количественное определение" рН = 9. Надо отметить, что использование СО при спектрофотометрическом определении подлинности известных веществ нерационально, т.к. характеристические значения абсцисс экстремумов в соответствующих электронных и колебательных спектрах имеют фиксированные значения при соблюдении предписанных условий эксперимента. При этом отказ от использования СО минимум в 2 раза сокращает продолжительность и заметно повышает точность анализа: величина RSD результата отдельного определения не превышает 2%. Результаты, полученные при разработке методики количественного определения ДРВ, подтверждают, что в ОФС имеются очевидные ошибки, перечнеленные ранее. Её следует привести в соответствие с ОФС "Определения, основанные на измерении поглощения света", включённой в ГФ СССР X издания (1968 г.). В последней указано, что при использовании известного значения удельного показателя поглощения относительная ошибка спектрофотометрических определений концентрации индивидуальных соединений < 2%. В настоящее время, спустя 50 лет, благодаря улучшению качества используемых приборов и оборудования, эта величина редко превышает 1% (табл. 4). Несмотря на это, в ОФС бездоказательно утверждается, что использование значений удельных показателей поглощения при количественных определениях приводит к получению результатов с относительной ошибкой ~ 10%. Полученные в данной работе результаты подтверждают необходимость прекращения в РФ практики целенаправленного лоббирования применения дорогостоящих импортных СО при разработке нормативных документов, регламентирующих качество фармацевтических продуктов. Такая практика не только антинаучна, она вредна экономически и подрывает лекарственную безопасность страны.

Авторы:

Издание: Химико-фармацевтический журнал
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 6.-С.53-60. Библ. 7 назв.
Просмотров: 151