ВЛИЯНИЕ ЦИТОФЛАВИНА НА ДНК ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ НАЛИЧИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ СИНТАЗЫ ОКИСИ АЗОТА

Аннотация:

Проанализированы результаты обследования 90 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) — стабильной стенокардией напряжения. Методом полимеразной цепной реакции определяли генные полиморфизмы эндотелиальной синтазы окиси азота (eNOS) С786Т. Методом ДНК-комет по разработанному нами способу в тестах in vitro оценивали влияние цитофлавина на ДНК лейкоцитов крови больных. Обнаружено наличие генных полиморфизмов по аллелям eNOS С786Т: 7 обследованных больных (8%) являлись гомозиготами по полиморфному аллелю (генотип СС); 48 человек (53%) — гомозиготами по дикому аллелю (генотип ТТ); а 35 человек (39%) — гетерозиготы (генотип СТ). Выявили более тяжёлое клиническое состояние больных, имеющих полиморфный аллель эндотелиальной синтазы окиси азота eNOS С786Т (генотипы СС и СТ): выше частота сердечных сокращений, гипергликемия, более высокий уровень креатинина и калия в крови, сниженный уровень индуцибельной синтазы окиси азота в лизате эритроцитов, повышенные уровни циклической АМФ и соотношения цАМФ к цГМФ в сыворотке крови. При введении цитофлавина in vitro обнаружили тенденцию разнонаправленного изменения состояния ДНК в зависимости от наличия полиморфизма гена eNOS С786Т. Так, у пациентов с полиморфным геном eNOS наблюдали увеличение показателя прироста процента ДНК в хвосте кометы, а у пациентов с диким генотипом eNOS — уменьшение данного показателя, что может свидетельствовать о способности цитофлавина модулировать стабильность ДНК в зависимости от исходного состояния генома и о необходимости разработки персонализированных подходов к использованию цитофлавина у пациентов с ИБС в клинической практике. Ключевые слова: фармакогенетика; полиморфизм гена eNOS С786Т; ишемическая болезнь сердца; метаболические корректоры; цитофлавин; персонализированная медицина. ВВЕДЕНИЕ: Фармакогенетику считают одним из наиболее перспективных направлений так называемой персонализированной медицины, которая обозначена Президентом Российской Федерации В. В. Путиным в качестве стратегического направления научно-технического развития страны. Фармакогенетика изучает роль генетических факторов в формировании ответа организма человека на лекарственные средства. Методы генотипирования позволяют прогнозировать ответ на лекарственные средства, что может значительно повысить эффективность и безопасность применения лекарственных препаратов. При выявлении соответствующего аллельного варианта у больного необходима коррекция терапии (доза, путь введения и его кратность, замена лекарственного препарата и т.д.). Изучение генов, ответственных за фармакокинетику и фармакодинамику лекарственных средств, широко внедряется в клиническую практику во всех развитых странах, является предметом клинических исследований. Высокая распространённость и смертность от ишемической болезни сердца (ИБС) в нашей стране и за рубежом, несмотря на принятые стандарты лечения данной патологии, требуют осуществления новых подходов к медикаментозной коррекции данного состояния. Патогенетически обоснованным и достаточно перспективным является использование препаратов метаболического ряда в комплексном лечении ИБС, однако их назначение в реальной клинической практике ограничено из-за наблюдаемой неоднозначной эффективности и отсутствия доказательств влияния на продолжительность жизни больных. Одним из возможных решений указанной проблемы может быть необходимость разработки персонализированных подходов к назначению метаболических корректоров кардиологическим больным. В этой связи представляет интерес изучение фармакогенетического фактора как одной из главных составляющих индивидуального выбора препаратов метаболического ряда у пациентов с ИБС. По данным литературы, фармакогенетика метаболических корректоров другими авторами не изучалась. Предметом нашего изучения явился препарат метаболического ряда цитофлавин (ООО "НТФФ "ПОЛИ-САН", Санкт-Петербург), который согласно официальной инструкции по применению относится к группе препаратов, улучшающих мозговой метаболизм. Цитофлавин активирует процессы клеточного дыхания и энергообразования, улучшает процессы утилизации кислорода тканями, восстанавливает активность ферментов, обеспечивающих антиоксидантное действие, улучшает мозговое и коронарное кровообращение, проявляет свойства кардиоцитопротектора, повышает толерантность к физической нагрузке. Исходя из механизма действия цитофлавина как комплексного препарата, состоящего из 4 компонентов (янтарной кислоты, инозина, рибофлавина и никотинамида) нами были выбраны 2 наиболее вероятные фармакодинамические мишени, потенциально зависимые от генетического фактора — это митохондрии и эндотелий сосудов. Обоснованием выбора мишеней является механизм синергичного действия компонентов цитофлавина. Янтарная кислота как внутриклеточный метаболит цикла Кребса под влиянием фермента сукцинатдегидрогеназы (СДГ) трансформируется в следующий метаболит — фумаровую кислоту, стимулируя аэробный гликолиз и тканевое дыхание; рибофлавин (витамин В2) является флавиновым коферментом СДГ и, следовательно, активирует работу сукцинатдегидрогеназы и других ферментов цикла Кребса; никотинамид (витамин РР) в клетках трансформируется в форму никотинамидадениннуклеотида (НАД) и его фосфата (НАДФ), активируя никотинамид-зависимые ферменты цикла Кребса, необходимые для клеточного дыхания и стимуляции синтеза АТФ; инозин (рибоксин) является предшественником АТФ, обладает способностью активировать ряд ферментов цикла Кребса, стимулируя синтез ключевых ферментов-нуклеотидов — флавинадениндинуклеотида (ФАД) и НАД. В процессе метаболизма в организме инозин превращается в гипоксантиннуклеотид — инозинмонофосфат (ИМФ), который может преобразовываться как в аденозинмонофосфат (АМФ) за счет трансформирования с аспаргиновой кислотой, так и в гуанозинмонофосфат (ГМФ), превращаясь вначале в ксантозинмонофосфат, а затем подвергаясь прямому аминированию/ Следовательно, при введении инозина увеличивается содержание субстрата ГМФ в эндотелии, что способствует росту концентрации цГМФ и потенцированию вазодилататорного эффекта. Приведенные данные свидетельствуют о непосредственном воздействии цитофлавина на митохондрии и о потенциальной возможности влияния данного препарата на эндотелий сосудов. Гены, определяющие активность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в митохондриях — это гены митохондриальной супероксиддисмутазы (СОД), имеющие клинически значимые полиморфизмы: мутация 1 митохондриальной СОД2 MnSOD Т58С и мутация 2 митохондриальной СОД2 MnSOD С60Т. Функция эндотелия сосудов, а именно способность последнего вырабатывать вазодилатирующий фактор — оксид азота — во многом определяется активностью фермента эндотелиальной NO-синтазы. Ген, кодирующий синтез данного фермента, обладает клинически значимым полиморфизмом eNOS С786Т, определяющим гетерогенность генотипа и замену тимина на цитозин. Целью настоящего исследования явилось изучение характера влияния цитофлавина на ДНК лейкоцитов крови пациентов с ИБС (по данным тестирования in vitro) в зависимости от полиморфизма гена эндотелиальной синтазы окиси азота. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ: Объектом исследования явились лейкоциты крови 90 пациентов с ИБС — стабильной стенокардией напряжения, 63 мужчин и 27 женщин в возрасте от 37 до 81 года (средний возраст больных составил (59,26±0,74) лет). Проводили клиническое обследование больных в исходном статусе, при поступлении в отделения кардиологии № 1 и № 2 Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Каждый участник был ознакомлен с программой исследования и подписал информированное согласие. У большинства больных стенокардия сочеталась с гипертонической болезнью — 80(89,4%), нарушениями ритма — 22(24,4%), постинфарктным кардиосклерозом — 44(48,8%), хронической сердечной недостаточностью — 85(94,4%), у некоторых — с сахарным диабетом II типа — 21(23,1%). Диагноз стабильной стенокардии напряжения верифицировали после проведения клинического, инструментального, лабораторного обследования согласно рекомендациям Всероссийского научного общества кардиологов (ВНОК) (2008) и Европейского общества кардиологов (ЕОК) (2013). Программа обследования больных включала в себя выполнение общих клинических методов исследования, инструментальных и лабораторных, в том числе электрокардиографии, эходопплеркардиографии, коронарографии, тредмил-теста, общего и биохимического анализов крови с определением коагулограммы, уровня глюкозы, калия, креатинина и других показателей согласно рекомендациям ВНОК (2008) и ЕОК (2013). Изучали также ключевые метаболиты функциональных систем, которые отвечают за процесс адаптации — стресс-реализующей (кортизол, цАМФ, индуцируемая синтаза окиси азота) и стресс-лимитирующей (инсулин, цГМФ, эндотелиальная синтаза окиси азота) систем. Изучение гормонов, ферментов и внутриклеточных мессенджеров с противоположным регуляторным действием позволяет судить о состоянии гуморальной регуляции. Концентрацию кортизола, инсулина, цАМФ и цГМФ определяли в сыворотке крови, а уровни эндотелиальной и индуцируемой синтаз окиси азота в лизате эритроцитов — методом иммуноферментного анализа на аппарате BioRad (Франция) (с помощью наборов реактивов фирмы "БиоХимМак" (Россия). Исследования проводили на базе клинико-диагностической лаборатории Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Генные полиморфизмы аллелей СОД2 MnSOD Т58С, СОД2 MnSOD С60Т и eNOS С786Т определяли методом полимеразной цепной реакции с помощью готовых наборов реактивов фирмы ООО НПФ "Литех" (Россия) в лаборатории популяционной генетики и генотоксикологии НИУ "БелГУ". Индивидуальную чувствительность ДНК лейкоцитов крови больных на введение цитофлавина изучали методом ДНК-комет путём тестирования препарата in vitro по разработанному нами способу. Методом ДНК-комет определяли показатель прироста процента ДНК в хвосте кометы. Исследования методом ДНК-комет проводили в лаборатории популяционной генетики и генотоксикологии НИУ "БелГУ". Статистическую обработку материала выполняли методом вариационной статистики. Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью теста Колмогорова — Смирнова. Для показателей, имеющих распределение, близкое к нормальному, осуществляли расчет среднего арифметического значения, стандартного (среднеквадратического) отклонения и ошибки среднего. Для количественных показателей, имеющих распределение, отличное от нормального, а также для порядковых показателей рассчитывали среднее значение, медиану, 25 и 75% квартили. Различие между 2 группами оценивали по t-критерию Стьюдента, U-критерию Манна — Уитни. Результаты считали статистически достоверными при р<0,05. Использовали критерий хи2: Для оценки соответствия выборочного распределения заранее заданным распределениям (закону Харди — Вайнберга). Для оценки результатов исследования методом ДНК-комет использовали программное обеспечение CometAssey. При проведении расчетов использовали программы "Microsoft Excel 2007" и "SPSS for Windows 11.0". РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ: По первому и второму генам митохондриальной суперокеиддисмутазы 2 в результате анализа выборки мутантных аллелей не выявлено, т.е. все исследуемые пациенты были гомозиготны по дикому аллелю и не имели митохондриальных болезней. Исследование полиморфизма гена eNOS С786Т выявило высокую степень изменчивости анализируемой выборки пациентов по данному генетическому маркеру (рис. 1). Так, 7 человек (8%) являлись гомозиготами по полиморфному аллелю (генотип СС), 48 человек (53%) являлись гомозиготами по дикому аллелю (генотип ТТ), а 35 человек (39%) — гетерозиготы (генотип СТ). Частота аллеля С равна 0,272; частота аллеля Т равна 0,728. Уровень генетической изменчивости относительно высок (I=0,585), а коэффициент инбридинга колеблется около нуля (F=0,011). Генотипическая структура исследуемой выборки по гену eNOS в целом соответствует закону Харди — Вайнберга (%2=0,012, р=0,913, Df=1) о панмиктической популяции в отсутствие естественного отбора. Проводили сравнительный анализ между группами пациентов, имеющих дикий и полиморфный ген эндотелиальной синтазы окиси азота eNOS С786Т. Получили ряд достоверных отличий (таблица). У носителей полиморфного гена эндотелиальной синтазы окиси азота eNOS С786Т (генотипов СС и СТ) наблюдали ряд особенностей: выше частота сердечных сокращений почти на 10 ударов в минуту (что может негативно отражаться на будущей продолжительности жизни), гипергликемия, более высокий уровень креатинина и калия в крови (возможна связь с функциональной активностью почек), практически в 2 раза сниженный уровень индуцируемой синтазы окиси азота в лизате эритроцитов, повышенный уровень циклической АМФ и соотношения цАМФ к цГМФ в сыворотке крови (как отражение снижения активности стресс-лимитирующих и повышения активности стресс-реализующих систем на уровне гуморальной регуляции и внутриклеточных мессенджеров). При введении цитофлавина in vitro обнаружили тенденцию разнонаправленного изменения состояния ДНК в зависимости от наличия полиморфизма гена eNOS С786Т. Так, у пациентов с полиморфным геном eNOS наблюдали увеличение показателя прироста процента ДНК в хвосте кометы, а у пациентов с диким генотипом eNOS — уменьшение данного показателя, что свидетельствует об активации процессов разрушения ДНК в первом случае и процессов восстановления молекулы ДНК во втором случае (рис. 2). Эндотелиальная синтаза окиси азота eNOS представляет собой фермент, ответственный за синтез в сосудистой стенке NO — важнейшего вазодилатотора, антиагреганта, антимитогена и антиоксиданта. В сосудистом эндотелии NO играет ключевую роль в релаксации и снижении миграции и пролиферации сосудистых гладкомышечных клеток, ингибировании адгезии тромбоцитов и лейкоцитов к эндотелию, ингибировании окисления липопротеинов низкой плотности. Многогранность функций оксида азота как эндотелиального фактора вазодилатации и как медиатора NO-стресс-лимитирующей системы широко описано в литературе и согласуется с результатами нашего исследования. Ген эндотелиальной синтазы окиси азота локализуется в 7-й хромосоме. Мутация в полиморфном участке гена eNOS С786Т ассоциируется с уменьшением продукции NO и может являться причиной спазма коронарных артерий. Полученные нами данные, во-первых, показывают прямую связь наличия полиморфизма гена eNOS С786Т и снижения продукции синтазы окиси азота (индуцируемой); во-вторых, демонстрируют ассоциацию данного явления с показателями ухудшения клинического состояния больных со стенокардией напряжения (увеличением ЧСС, повышением содержания глюкозы, креатинина, калия в крови), и, в-третьих, отражают процессы активации стресс-реализующих систем у больных со стенокардией (по показателям повышения концентрации цАМФ, цАМФ/цГМФ в крови) в условиях недостаточного синтеза окиси азота. Выявленная нами способность цитофлавина по-разному влиять на состояние ДНК лейкоцитов крови у пациентов с ИБС в зависимости от генотипа по eNOS С786Т является новой. В литературе имеются отдельные публикации других авторов, которые определяли способность цитофлавина влиять на процесс апоптоза в клетках головного мозга животных - как индуцировать, так и подавлять, что расценивалось авторами как умеренная модуляция процесса апоптоза. Возможно, и в нашем случае следует говорить о способности цитофлавина модулировать стабильность ДНК в зависимости от исходного состояния генома. Исходя из результатов проведенного исследования, гипотетически можно сказать, что наличие дисфункции эндотелия вследствие снижения активности эндотелиальной синтазы окиси азота у пациентов с полиморфным геном eNOS С786Т с соответствующим ограничением возможности выработки N0, предопределяет ограничения возможности препарата, механизм действия которого связан с функцией эндотелия. Поскольку цитопротекторная эффективность цитофлавина оказывается зависимой от функционального состояния эндотелия, о чём было сказано выше, логичным представляется объяснение влияния данного метаболического корректора на ДНК клеток в зависимости от генотипа eNOS, представленное в нашей работе. Полученные данные свидетельствуют о возможной необходимости разработки персонализированных подходов к использованию цитофлавина в кардиологической практике, что требует проведения соответствующих клинических исследований. ВЫВОДЫ: 1. Среди пациентов с ИБС обнаружено наличие генных полиморфизмов по аллелям эндотелиальной синтазы окиси азота eNOS С786Т: 7 обследованных больных (8%) являлись гомозиготами по полиморфному аллелю (генотип СС), 48 человек (53%) — гомозиготами по дикому аллелю (генотип ТТ), а 35 человек (39%) — гетерозиготы (генотип СТ). 2. У пациентов с ИБС, имеющих полиморфный ген эндотелиальной синтазы окиси азота eNOS С786Т (генотипы СС и СТ), обнаружен ряд особенностей, по сравнению с обладателями дикого генотипа по данному аллелю (ТТ), выше ЧСС, гипергликемия, более высокий уровень креатинина и калия в крови, сниженный уровень индуцируемой синтазы окиси азота в лизате эритроцитов, повышенные уровни циклической АМФ и соотношения цАМФ к цГМФ в сыворотке крови. 3. Цитофлавин in vitro проявил тенденцию разнонаправленного влияния на ДНК в зависимости от наличия полиморфизма гена eNOS С786Т. Так, у пациентов с полиморфным геном eNOS наблюдали увеличение показателя прироста процента ДНК в хвосте кометы, а у пациентов с диким генотипом eNOS — уменьшение данного показателя, что может свидетельствовать о способности цитофлавина модулировать стабильность ДНК в зависимости от исходного состояния генома

Авторы:

Издание: Экспериментальная и клиническая фармакология
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 6.-С.14-19. Библ. 28 назв.
Просмотров: 116