Возможности клинической фармакогенетики в персонализированном применении антибактериальных-лекарственных средств в клинической практике при муковисцидозе

Аннотация:

Ключевые слова: биотрансформация ксенобиотиков, полиморфные варианты генов, нежелательные побочные эффекты, фармакогенетика, муковисцидоз, антибактериальная терапия. В статье представлен современный взгляд на фармакокинетику лекарственных препаратов, ее связь с фармакогенети-кой как основой персонифицированной терапии. Проведена оценка влияния полиморфизма генов 1 и 2 фазы биотрансформации ксенобиотиков на колонизацию микробными патогенами дыхательного тракта больных муковисцидозом, эффективность антибактериальной терапии и частоту нежелательных побочных реакций. Муковисцидоз (MB) - моногенное заболевание, с высокой частотой встречающееся в российской популяции (заболеваемость 1:10 498 новорожденных) . MB обусловлен мутациями гена CFTR, приводящими к нарушению синтеза белка, формирующего хлорный канал. Нарушение хлорного канала CFTR изменяет свойство секрета, продуцируемого железами многих органов: легких, печени, тонкого кишечника, поджелудочной железы, тес-тикулами. В респираторном тракте продукция густой слизи приводит к нарушению мукоцилиарного транспорта и, как следствие, хроническому течению бактериального инфекционного процесса, развитию жиз-неугрожающих состояний. Тяжесть клинических проявлений MB обусловлена действием большого числа факторов: типом мутаций гена CFTR, влиянием генов-модификаторов, факторов внешней среды. Больные MB представляют одну из самых тяжелых категорий пульмонологических больных, а корректная антибактериальная терапия (АБТ) респираторной инфекции при MB определяет прогноз течения заболевания. Учитывая особенности бронхолегоч-ного процесса, вызванные функционированием канала муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости (МВТР), антибактериальную терапию рекомендуется применять в максимальных возрастных дозах и курсами не менее 14-21 дней. От эффективности антибактериальной терапии зависят качество и продолжительность жизни больных муковисцидозом, в связи с чем исследование причин антибактериальной резистентности и нежелательных побочных явлений у данной категории больных является перспективным направлением, способствующем решению проблем больных MB. Цель исследования Изучить влияние полиморфизма генов 1 и 2 фазы биотрансформации ксенобиотиков на колонизацию микробными патогенами дыхательного тракта больных муковисцидо-зом, определить эффективность антибактериальной терапии и частоту нежелательных побочных реакций (НПР). Объекты исследования Проведено генотипирование больных му-ковисцидозом, проживающих в Московском регионе (MP) и Республике Беларусь (РБ). На всех пациентов заполнены анкеты и от каждого из них получено письменное информированное согласие на проведение медико-генетических исследований. Сравнение проводилось согласно требованиям Европейского регистра больных MB . Диагноз муковисцидоза устанавливали согласно европейским стандартам . В данное исследование вошло 307 пациентов: 197 из MP и 110 из РБ. Живы 301 (193 и 108 из MP и РБ соответственно). Средний возраст составил 9,6 ±7,5 лет (9,8±8,3 лет MP, 9,2±6 РБ). Количество пациентов старше 18 лет составило 46 человек (15,3%): 35 в MP (18,4%) и 11 в РБ (10%). Число женщин составило 150 человек (48,9%), мужчин - 157 человек (51,1%). В гомозиготном состоянии мутация F508del выявлена у 132 пациентов из общей группы, что составило 44% (в MP и РБ данный показатель составил 88 (46,3%) и 44 (40%) соответственно). Исследование проводили в общей группе и группе пациентов гомозигот по F508del. Пациенты Беларуси наблюдались на базе стационаров ГБУЗ «Краевая клиническая больница», Московского региона — в Российском центре муковисцидоза на базе отделения муковисцидоза ГБУЗ Московской области «Московский областной консультативно-диагностический центр для детей» и ФГБУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России. Дизайн исследования - «случай-контроль», группы сравнения формировались в зависимости от критериев включения. Деление пациентов на группы проводилось с учетом микрофлоры дыхательного тракта (дизайн 1), количества курсов внутривенной антибактериальной терапии в год (дизайн 2) и количества нежелательных побочных реакций (дизайн 3) (табл. 1). Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» (протокол № 9 от 22.12.2015) и УЗ «3-я городская детская клиническая больница г. Минска» (протокол № 5 от 26.11.2015). Методы исследования. I. Клинико-анамнестический метод. Заполнение регистра Московского региона с внесением информации о побочных действиях, серьезных нежелательных реакциях, непредвиденных нежелательных реакциях по данным историй болезни и амбулаторных карт. II. Генетические методы. Молекулярно-генетический анализ проводился на тотальной ДНК, выделенной из лейкоцитов цельной крови с помощью стандартного метода фенол-хлороформной экстракции. Изучение полиморфизма генов биотрансформации проводилось методом ПЦР и последующего ПДРФ-анализа с использованием праймеров, выбранных для исследования. Гены и полиморфизмы для исследования: GSTT1: делеции; GSTM1: делеции; GSTP1: c.313A>G; GCLC: тринуклеотидные повторы, GAG повторы; NAT2: 191G>A, 282С>Т, 341Т>С, 434А>С, 481С>Т, 590G>A, 803A>G, 845А>С, 857G>A; CYP2C9: CYP2C9*2 (430С>Т; R144C) и CYP2C9*3 (1075А>С; I359L); CYP219: CYP2C19*2 (681G>A); CYP2C19*3 (636G>A; W212X); CYP2D6: CYP2D6*4 (1846G>A); CYP3A4: CYP3A4MB (-392C>T), CYP3A4*3 (M445T). Статистический анализ. Качественные показатели представлены частотами и процентами в группах. При исследовании таблиц сопряженности использовался точный критерий Фишера. При исследовании генетического полиморфизма в группах также использовали точный критерий Фишера. Расчет статистической значимости генетических полиморфизмов и генотипов при изучении ответов на лечение с поправкой на возраст проводился на основе логистической регрессии. При включении коварианты возраста влияние генотипа на изучаемый ответ оценивалось на основе дисперсионных таблиц по F-критерию. Все расчеты проводились в статистическом пакете R, версия 3.4.2. Результаты анализа считались статистически значимыми при р<0,05. Результаты исследования. На первом этапе проводилось сравнение групп пациентов с MB в зависимости от генотипа по генам 1 и 2 фаз метаболизма ксенобиотиков и характера микрофлоры дыхательного тракта. Установлено, что частота хронического носительства патогенной флоры - неферментирующих грамотрица-тельных бактерий (НГОБ), растет с возрастом пациентов (рис.1). Возраст (Me (Q25; Q75)) больных в группе НГОБ составил 14 (9;20), а в случае грамположительной флоры, незначимой флоры - б (3;9), p-value <0.001. В связи с этим статистическая обработка проводилась в группах сравнения и с коррекцией на возраст (adjusted by age). Не выявлено различий частоты полиморфных вариантов генов 1 фазы биотрансформации ксенобиотиков (CYP2C9*3 I359L (с.1075А>С), CYP2C9*2 R144C (с.430С>Т), CYP2C19*2 681G>A, CYP2D6*4 (1846G>A), CYP3A4 *1В (-392С>Т)) в группах детей с муковисцидозом, у которых диагностировалась разная микрофлора респираторного тракта.Выявлена более низкая частота генотипа 7/9 гена GCLC (GAG) (19,8% против 35,7%) и более высокая частота генотипа 8/9 (12,9% против 3,8%) у пациентов с высокой патогенной микрофлорой по сравнению с группой пациентов с поражением верхних дыхательных путей этиологически незначимой микрофлорой (р=0.016 и р=0.032). Можно предположить, что носительство генотипа 8/9 гена GCLC у детей с MB является фактором, предрасполагающим к ранней хронической колонизации слизистой респираторного тракта патогенной флорой (табл. 2). Не выявлено взаимосвязи полиморфизма гена NAT2 и характера микрофлоры дыхательного тракта у пациентов с MB. С учетом принятых разделений людей на группы ацетиляторов были выделены группы больных: R/R - «быстрые» ацетиляторы, R/S -«промежуточные» ацетиляторы, S/S -«медленные» ацетиляторы. Исходили из того, что к аллелям «быстрых» (R/R) ацетиля-торов относятся: NAT2*4, NAT2*11, NAT2*12 (ABCD), NAT2*13, NAT2*18; аллели «медленных» (S/S) ацетиляторов включают: NAT2*5 (А, В CD EF, G Н J, J), NAT2*6 ABC D E), NAT2*7 (A B), NAT2*10, NAT2*14 (А, ВС, DEF, G), NAT2*17, NAT2*19. Сочетания «быстрых» и «медленных» аллелей проявляются фени-кипически как «быстрые» или «промежуточные» ацетиляторы (R/S) [4]. Однако различий в группах получено не было. Частота генотипа 7/9 гена GCLC (GAG) у пациентов, гомозиготных по мутации F508del, была ниже, а частоты генотипов 7/8 и 8/9 выше в группе пациентов, имеющих хроническое носительство патогенной флоры слизистой респираторного тракта (р= 0.007 и р =0.002) (табл. 3). Генотип ТТ гена NAT2 (282С>Т) и генотип АА гена NAT2 (590G>A) связаны с пониженным риском колонизации патогенной флорой при учете возраста пациентов (р=0.007). «Медленные» аллельные варианты гена NAT2 способствуют снижению уровня фермента N-ацетилтрансферазы, замедляя реакцию превращения ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА. В настоящее время установлена ассоциация полиморфизма гена NAT2 с различными заболеваниями и различной чувствительностью к лекарственным препаратам. «Медленные» ацетиляторы характеризуются более продолжительным фармакологическим эффектом, и в то же время обнаруживают повышенную чувствительность к некоторым лекарственным препаратам и побочным иммуно-токсическим эффектам ариламинов и гидразинов (табл. 4). Таким образом, генотипы GSTT1*D/D, GCLC*7/9, NAT2* ТТ (282С>Т) и NAT2*AA (590G>A) ассоциированы с пониженным риском колонизации патогенной флорой, и их можно рассматривать как генотипы пониженного риска колонизации слизистой респираторного тракта патогенной флорой и, соответственно, (как причину) развития обострений микробно-воспалительного процесса дыхательного тракта. Сравнение количества курсов антибактериальной терапии в год от полиморфных вариантов генов 1 и 2 фаз трансформации ксенобиотиков проводили на следующем этапе. Деление пациентов на группы с высокой и низкой частотой бронхо-легочных обострений проводилось с учетом количества курсов внутривенной антибактериальной терапии в год. Как показано ш рисунке 2, частота курсов внутривенной терапии повышается с возрастом больных. Возраст пациентов с MB, получающих в год 3 и более курса внутривенной терапии, составил по Me (Q25; Q75) - 12 (б; 19) лет, а в группе со спорадической терапией - 5 (3; 8) лет, p-value <0.001. Установлена ассоциация полиморфизма гена первой фазы биотрансформации ксенобиотиков, CYP3A4 *1В (-392С>Т) и частоты антибактериальной внутривенной терапии у пациентов с муковисцидозом в общей группе (табл. 5). Носители генотипа СТ чаще имеют патогенную флору и получают антибактериальную терапию. Показана ассоциация полиморфизма генетических вариантов гена NAT2 (481С>Т) и генотипа ТТ с высокой потребностью во внутривенной антибактериальной терапии у пациентов с муковисцидозом, как с учетом возрастных различий, так и при их нивелировании (р=0,016). Взаимосвязи полиморфизма других генов первой и второй фаз биотрансформации ксенобиотиков и частоты антибактериальной внутривенной терапии не выявлено. В группе пациентов, гомозиготных по мутации F508del гена CFTR, зависимости изучаемого признака от генотипов генов 1-ой и 2-ой фаз биотрансформации ксенобиотиков не наблюдалось. На последнем этапе изучали частоту нежелательных побочных реакций (НПР) и их зависимость от полиморфных вариантов 1 и 2 фаз трансформации ксенобиотиков. Нежелательная реакция - любая неблагоприятная и непреднамеренная реакция организма, возникающая при применении лекарственного препарата. Реакция считается связанной с лекарственным препаратом, если причинно-следственную связь нельзя исключить (адаптировано из ICH E2D). Неблагоприятная побочная реакция -это любая непреднамеренная и вредная для организма человека реакция, возникающая при использовании препарата в обычных дозах с целью профилактики, лечения и диагностики. С 1968 г. действует международная программа мониторинга безопасности лекарственных средств ВОЗ. С начала 90-х гг. разработаны международные научные и технические стандарты для сбора и обработки информации о лекарственных средствах (CIOMS, ICH). В ЕС в 2012 г. вступило в силу новое законодательство в области фармаконадзора.При муковисцидозе, учитывая поликомпонентную терапию заболевания и применение антибактериальных препаратов длительно и в высоких дозах, НПР могут серьезно повлиять не лечение и исход болезни [1]. НПР возникали у 36 пациентов и зависели от возраста пациентов (рис. 3), при этом у детей до 10 лет включительно у 15/166 (8,3%) больных, а старше 10 лет - у 21/58 (26,6%). Влияние полиморфизма генов 1-й фазы (CYP2C9*3 I359I(c.l075A>C), CYP2C9*2 R144C (с.430С>Т), CYP2C19*2 (681G>A), CYP2D6*4 (1846G>A), CYP3A4 *1B (-392C>T)) и 2-й фазы (GSTP1, c.313A>G, GSTT1, GSTMI, GCLC, GAGn) биотрансформации ксенобиотиков на частоту НПР у пациентов с муковисцидозом в общей группе не обнаружено. Установлена ассоциация полиморфизма генетических вариантов гена NAT2 (NAT2 (481 С>Т), р=0,001) и NAT2 (803 A>G), р=0,036) с частотой НПР у пациентов с муковисцидозом, как с учетом возрастных различий, так и при их нивелировании (табл. 6). У пациентов с генотипами СС и ТТ гена NAT2 (481 С>Т) и генотипом АА гена NAT2 (803 A>G) чаще развивались НПР. Пациенты были разделены на группы ацети-ляторов: R/R - «быстрые» ацетиляторы, R/S - «промежуточные» ацетиляторы, S/S -«медленные» ацетиляторы. Однако статистически значимых различий получено не было. В группе больных, гомозиготных по мутации F508del, не было возрастной зависимости НПР. Подтверждена ассоциация генетического варианта гена NAT2 (NAT2 481С>Т) с частотой НПР у пациентов с муковисцидозом, но большая предрасположенность была выявлена у больных с генотипом СС. Обнаружена ассоциация генетического варианта NAT2 (590G>A) и генотипа АА с НПР у пациентов, гомозиготных по мутации F508del (р=0,005) (табл. 7). Так, НПР встречались у 26,7% пациентов, и не встречались у 2,5%. При делении больных на группы ацетиляторов ассоциаций НПР с видом аце-тилятора не выявлено. Обсуждение В проведенном исследовании были выявлены достоверно более низкая частота генотипа 7/9 гена GCLC (GAG) и более высокая частота генотипа 7/8 и 8/9 у пациентов с высоко патогенной микрофлорой по сравнению с группой пациентов с поражением верхних дыхательных путей этиологически незначимой микрофлорой. Можно предположить, что носительство генотипа 8/9 гена GCLC, является фактором, предрасполагающим к ранней хронической колонизации слизистой респираторного тракта патогенной флорой у детей с MB. Известно, что реакция, осуществляемая ферментом глутаматцистеинлигазой (GCL), является лимитирующей в синтезе глутатиона. Фермент глутаматцистеинлигаза (GCL) гетеро-димер состоит из каталитической (GCLC) и регуляторной субъединиц (GCLM). Каталитическая субъединица обеспечивает каталитическую активность фермента, а регу-ляторная повышает каталитическую эффективность. Ген каталитической субъединицы глутаматцистеинлигазы (GCLC) располагается в регионе 6р12 . 5'- не транслируемый регион м-РНК GCLC содержит полиморфный тринуклеотидный повтор GAG вблизи от стартового кодона. В экспериментах на клеточных линиях человека показано, что данный полиморфизм ассоциирован с разными уровнями глутатиона: аллель, содержащий 7 повторов GAG, связан с самым низким уровнем глутатиона, аллель 8 - со средним, а аллель 9 - с высоким уровнем глутатиона . Глутатион играет критическую роль в механизме клеточной детоксикации, защиты клеток от окислительного стресса и реактивных видов кислорода, апоптозе лимфоидных клеток и репрограммировании Т-клеточной активации и пролиферации в процессе воспаления . МВ-опосредованные дефекты легочного эпителия и устойчивая активация полиморфноядерных лейкоцитов рецидивирующими инфекциями создают условия для аномального потока реактивных форм кислорода в легком при MB между событиями острого и хронического воспаления. Нарушение функции хлорного канала, кодируемого геном CFTR, по-видимому, вызывает дисбаланс редокс-системы в эпителиальных клетках и внеклеточных жидкостях, приводя к повышению образования реактивных видов кислорода. Данный дефект метаболизма глутатиона, наряду с пониженным потреблением и абсорбцией жирорастворимых анти-оксидантных витаминов (витамин Е и каро-тиноиды), может способствовать дефектной антиоксидантной защите. Считается, что это ведет к усилению окислительного стресса и прогрессированию заболевания.Исходя их вышесказанного, мы можем констатировать, что генотип GCLC*7/9 ассоциирован с пониженной колонизацией слизистой респираторного тракта патогенной флорой в общей группе пациентов с MB, что объясняется низким уровнем глутатиона, а генотипы GCLC*7/8 и GCLC*8/9 - повышенной колонизацией и высоким уровнем глутатиона. Исследование генов 2 фазы показало следующие результату Генотип DD гена GSTT1(р=0.020) чаще встречался у лиц с этиологически незначимой микрофлорой дыхательного тракта. Наличие делеций в гене GSTT1 приводит к синтезу функционально неактивного фермента глутатион-S-трансферазы у носителей гомозиготных генотипов, GSTT1*D/D, что обусловливает низкую скорость инактивации лекарственных препаратов и, вероятно, большую эффективность антибактериальной терапии. Это обстоятельство может объяснить более эффективную эррадикацию патогенной флоры и снижение риска формирования хронического микробно-воспалительного процесса. Частота НПР при муковисцидозе ассоциирована в общей группе пациентов и группе гомозигот по мутации F508del с полиморфными вариантами гена NAT2 (NAT2 (481 С>Т) и NAT2 (590 G>A), которые относят к «медленным» аллелям гена NAT2. Возможно, что медленный процесс ацетилирова-ния приводит к длительному накоплению препарата и НПР. Следует отметить, что несмотря на данный факт, при генотипе АА гена NAT2 (590 G>A), когда НПР встречаются у 26,7% против 2,5% больных, у которых они не встречаются, патогенная микрофлора диагностируется в 2 раза реже. Вероятно, длительное накопление антибактериальных препаратов, с одной стороны, способствует быстрой эр-радикации патогенной флоры, а с другой -возникновению НПР. В то же время при генотипе ТТ гена NAT2 (481С>Т) чаще встречаются НПР на фоне частых курсов внутривенной терапии, однако не было установлено связи с характером микрофлоры дыхательного тракта. Вероятно, НПР при MB могут возникать у пациентов с медленным метаболизмом антибактериальных препаратов, а также при частых курсах антибактериальной терапии. Таким образом, нами получены первые данные, которые могут в будущем способствовать прогнозированию эффективности антибактериальной терапии и развития НПР, а также склонности к колонизации дыхательного тракта больных муковисцидозом патогенной микрофлорой.

Авторы:

Издание: Вестник Росздравнадзора
Год издания: 2018
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.68-76. Библ. 11 назв.
Просмотров: 54