Стуктурно-функциональные изменения нейронов неокортекса белых крыс после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий

Аннотация:

Цель исследования — изучение структурно-функциональных изменений нейронов сенсомоторной коры головного мозга белых крыс в норме и после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий. Методика. С помощью световой (окраска гематоксилином и эозином, по Нисслю), флуоресцентной (окраска DAPI), иммунофлуоресцентной (нейрон-специфическая енолаза — NSE) и электронной микроскопии была изучена нейроцитоархитектоника сенсомоторной коры (СМК) головного мозга белых крыс в норме (п=5) и в динамике — 1, 3, 7, 14, 21 и 30 сут.; после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий (п=30). Согласно рекомендациям Nomenclature Committee on Cell Death (2009), проведено детальное описание и сравнение всех морфотипов измененных пирамидных нейронов СМК мозга белых крыс после острой ишемии. Морфометрический анализ проведен с помощью программы ImageJ 1.46. Результаты. Использование комплекса морфологических методов позволило классифицировать нейроны на основании четких структурных маркеров и доказать возможность апоптоза гиперхромных нейронов СМК после воспроизведения ишемии. Показано, что через 3 сут. в слое III 6—12% гиперхромных нейронов подвергалось апоптозу, 13,4—24,6% — коагуляционному некрозу, а остальные выходили из патологического состояния в отдаленном восстановительном периоде. Необратимо измененные клетки-тени составляли 11,5% (95% ДИ: 7,4—16,8%). Общая численная плотность пирамидных нейронов в течение 30 сут. постишемического периода в слое III СМК снижалась на 30,5% (95% ДИ: 24,2—38,7%), а в слое V — на 14,4% (95% ДИ: 9,9—20,0%). Заключение. Показана смешанная природа гибели нейронов — одновременное сочетание процессов некроза и апоптоза (парапоптоз). Однако основную роль в гибели нейронов играли процессы быстрого и отдаленного ишемического некроза. Ключевые слова: острая ишемия; белая крыса; неокортекс; нейроны; световая, флуоресцентная, электронная микроскопия; морфометрия; некроз; апоптоз. Введение. Необратимые изменения нейронных сетей коры головного мозга (КГМ) после острой ишемии являются причиной многих неврологических нарушений, которые по своему медико-социальному значению остаются одной из актуальных проблем современной медицины. Особое значение при этом уделяется заболеваниям, связанным с повреждением магистральных артерий головного мозга. В связи с этим представляет интерес изучение структурно-функционального состояния нейронов КГМ после острой дозированной по времени ишемии, вызванной окклюзией общих сонных артерий в эксперименте. Имеются исследования, в которых изучалось структурно-функциональное состояние нервных структур КГМ на различных экспериментальных моделях локальной, тотальной транзиентной, полной и неполной ишемии головного мозга, а также у человека на аутопсийном и биопсийном материале. В этих работах охарактеризованы основные реакции нейронов на ишемию и реперфузию. Гибель нейронов происходит путем некроза (острого, отсроченного, отдалённого) и апоптоза, а также сочетания обоих процессов — парапоптоза. Есть работы, посвященные изучению коры головного мозга белых крыс после окклюзии общих сонных артерий. Однако структурные механизмы реорганизации нервной ткани неокортекса в период реперфузии во многом остаются неясными. Особое значение для понимания механизмов повреждения и структурно-функционального восстановления высших отделов головного мозга млекопитающих при ишемии и реперфузии имеет изучение ультраструктуры различных поврежденных нейронов, так как это позволяет понять механизм гибели конкретной клетки (некроз или апоптоз). Флуоресцентные (окраска DAPI), иммунофлуоресцентные (NSE) методы дают дополнительную информацию о пространственном распределении ДНК в ядре и степени ее конденсации, используется для выявления различных этапов постишемической некротической и апоптозной трансформации ядра. Цель исследования — изучение с помощью световой, флуоресцентной (окраска DAPI), иммунофлуоресцентной (NSE) и электронной микроскопии морфофункционального состояния нейронов сенсомоторной коры головного мозга белых крыс в норме и в динамике после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий. Методика. Исследования проводили в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.77 № 755) и с рекомендациями Международного комитета по науке о лабораторных животных, поддержанных ВОЗ, директивой Европейского Парламента № 2010/63/EU от 22.09.10 «О защите животных, используемых для научных целей» и одобрена этическим комитетом ГБОУ ВПО Омского государственного медицинского университета. Эксперименты выполнены на самцах белых беспородных крыс массой 180—200 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Моделирование острой ишемии мозга проводили путем 20-минутной окклюзии общих сонных артерий (сосудистая модель неполной глобальной ишемии без гипотонии) на фоне премедикации (сульфат атропина 0,1 мг/кг, подкожно) и общей анестезии (Zoletil 100, 10 мг/кг). Материал для морфологического исследования нейронов брали через 1, 3, 7, 14, 21 и 30 сут. после окклюзии по 5 животных на каждый срок. Контролем служили интактные крысы (п=5). Головной мозг фиксировали путем перфузии смеси 1% раствора глютарового альдегида, 4% раствора параформа на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) и 5% раствора сахарозы через восходящую часть дуги аорты под давлением 90—100 мм рт.ст. и путем погружения в аналогичный раствор. Затем часть материала заключали в парафин, готовили фронтальные срезы (5 мкм) на уровне сенсомоторной коры (СМК). Эти срезы окрашивали по Нисслю и DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Для иммуногистохимической окраски использовали антитела к нейронспецифической енолазе (NSE), визуализацию иммунной реакции осуществляли с помощью козьих поликлональных вторичных антител, ассоциированных с флюоресцентным красителем TexasRed® Sulfonyl Chloride. Применялась двухканальная флуоресценция для одновременного выявления в нейронах ядер (DAPI — различные оттенки синего) и цитоплазмы нейронов (NSE — красная). Цифровые изображения получали с помощью камеры AxioCam MRc и объектива ЕС Plan-Neofluar х40 (апертура 0.9). Применялись 2 фильтра производства Karl Zeiss: для Texas Red® и DAPI. С помощью программы AxioVision формировались двухслойные графические файлы. Нейроны легко верифицировались, их цитоплазма окрашена в красный цвет (NSE). Для ультраструктурного исследования выделяли СМК, рассекали на пирамидные блоки, контрастировали 1—2 ч в 1% незабуференном растворе четырех-окиси осмия, промывали, обезвоживали и заключали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие (70—100 нм) срезы готовили на ультрамикротоме LKB-8800 (Швеция), окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали и фотографировали на микроскопе Hitachi-600H (Япония). На каждый срок фотографировали по 50 полей зрения при увеличении Х12 000. На оцифрованных электронограммах проводили качественную оценку ультраструктуры клеток. Статистический анализ осуществлялся с помощью программ MedCalc® и StatSoft Statistica 8.0. Проверку статистических гипотез проводили при помощи непараметрических критериев. В ходе проведения статистического анализа нулевая гипотеза отвергалась при р<0,05. Результаты и обсуждение: На рис. 1 показаны два поля зрения СМК головного мозга белой крысы в норме, окрашенные по Нисслю (а) и DAPI (б). При окраске по Нисслю можно было оценить общую численную плотность (ОЧП) перикарионов. Например, на рисунке 1, а, по данным морфометрического анализа, она составила 315/1 мм2. Глиальные клетки трудно различались среди других структур СМК, что затрудняло оценку их количества и размеров (рис. 1, а). Флуоресцентная окраска с помощью DAPI позволила надежно верифицировать нейроны (большие, круглые ядра темно-синего цвета с небольшим количеством конденсированного хроматина — яркое свечение) и астроциты (небольшие овальные, яркие светло-синие ядра) (рис. 2 и 3). Например, на рисунке 1, б ОЧП ядер нейронов составила 290, а глиальных клеток — 435 на 1 мм2. Таким образом, при использовании окраски по Нисслю и DAPI в одинаковых слоях СМК нами были получены близкие значения ОЧП нейронов. Однако окраска DAPI точно верифицировала ещё и ядра других клеток. По данным светооптического исследования, после острой ишемии в СМК выявлены: различные проявления гидропической дистрофии нервных клеток, очаговый и тотальный хроматолиз, эктопия ядер, гиперхроматоз, гомогенизация ядер и цитоплазмы, распад ядер и ядрышка, кариоцитолизис (клетки-тени), гиперхромные сморщенные клетки (пикноморфные) и нейронофагия. Превалировали гиперхромные ишемические изменения без сморщивания нейронов. Морфометрический анализ (для каждого срока оценивалось по 250 нейронов в произвольно взятых полях зрения) показал, что содержание наиболее типичных для острой ишемии гиперхромных нейронов (всех типов) статистически значимо изменялось в течение 30 сут. постишемического периода: в слое III (ANOVA, Н-критерий Краскела—Уоллиса =15,5, р=0,001) и слое V (14,7, р=0,002). На 3-й сут. после ишемии выявлено максимальное содержание гиперхромных нейронов в слое III — 62,5% (95% ДИ: 56,2—68,5%) и слое V — 58,5% (95% ДИ: 52,1—64,7%). В этот же срок отмечено максимальное содержание необратимо измененных клеток-теней — 11,5% (95% ДИ: 7,8—16,1%) и пикноморфных клеток — 18,5% (95% ДИ: 13,9—23,9%, слой III), 12,2% (95% ДИ: 8,4—16,9%, слой V). В сравнении с нормой (интактные животные) общая численная плотность пирамидных нейронов в течение 30 сут. постишемического периода в слое III СМК снижалась на 30,5% (95% ДИ: 24,9—36,6%), а в слое V — на 14,4% (95% ДИ: 10,3—19,4%). Таким образом, по данным светооптического исследования (окраска по Нисслю), после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий установлены диффузно-очаговые реактивные и патологические изменения нейронов СМК. Однако только часть этих нейронов острого периода (1 и 3 сут.) в последующем подвергалась необратимой деструкции и элиминации. При двойной окраске DAPI и на NSE было установлено, что нормохромные пирамидные нейроны имели большие округлые ядра с незначительным количеством конденсированного хроматина на фоне равномерного синего свечения окружающего эухроматина. В цитоплазме нейронов четко верифицировались скопления NSE (красные гранулы), что отличало их от ярких ядер глиальных клеток (рис. 2, а). В постишемическом периоде в ядрах гиперхромных нейронов увеличивалось количество конденсированного хроматина (рис. 2, б, в). В цитоплазме несморщенных гиперхромных нейронов выявляли высокое содержание NSE, что, вероятно, свидетельствовало о компенсаторной активации данного фермента гликолиза при ишемии. После острой ишемии вокруг реактивно измененных темных пирамидных нейронов прогрессивно увеличивалось количество астроцитов, максимально через 7 и 14 сут. Ядра этих клеток были мельче, чем ядра нейронов, содержали существенно больше конденсированного хроматина, что объясняет их очень яркое свечение (рис. 2, б, в). Среди реактивно измененных темных нейронов отмечали клетки с признаками апоптоза (рис. 2, г, д, е), относительное содержание которых через 1 сут. было на уровне 4% (95% ДИ: 1,9—7,2%), а через 3 сут. достигало максимума — 9% (95% ДИ: 5,8—13,3%). Выявили статистически значимую динамику содержания апоптозных клеток (слой III: Н =12,2, р =0,01; слой V: Н =11,4, р =0,03). При окраске DAPI фрагментированные апоптозные ядра отчетливо выявлялись в виде типичных групп, близко расположенных плотных флуоресцирующих телец ДНК-содержащего материала, что позволяло их легко идентифицировать (рис. 2, д). Необходимо отметить длительное сохранение в постишемическом периоде реакции на NSE в цитоплазме нейронов с конденсированным ядерным хроматином (гиперхромные и апоптозные клетки) (рис. 2. е). Проведено сопоставление различных морфотипов нейронов, выявленных при световой, флуоресцентной и электронной микроскопии. Функциональное состояние нейронов в ходе электронно-микроскопического исследования оценивали на основании сравнительного анализа показателей: 1) количества и распределения гетеро- и эухроматина, РНП-частиц (транскрипционной активности); 2) структурной организации ядрышка (размеры, форма, плотность, состав); 3) состояния ядерных мембран (инвагинации, поры, перинуклеолярное пространство); 4) белоксинтезирующего аппарата цитоплазмы (гранулярная эндоплазматическая сеть — ГЭС); 5) энергетической системы (популяции митохондрий); 6) аппарата Гольджи и системы вакуолей. Перикарион нормохромных нейронов на ультраструктурном уровне представлен крупным округлым ядром, содержащим ядрышко и гомогенную кариоплазму, а также цитоплазмой с клеточными органеллами. Конденсированного хроматина в ядрах было мало, превалировал эухроматин (рис. 3, а). Ультраструктурная организация нормохромных нейронов была сопоставима с результатами световой и флуоресцентной микроскопии этих клеток (рис. 1, а, 2, а) В постишемическом периоде в СМК белых крыс были выявлены изменения ультраструктуры всех ее компонентов — нейронов, их отростков (аксонов, дендритов), синапсов, глиальных клеток, а также микрососудов. Характер реактивных, деструктивных и компенсаторно-восстановительных изменений нейронов прежде всего зависел от периода: острый постишемический (1,3 сут.), ранний восстановительный (7, 14 сут.) и поздний восстановительный период (21, 30 сут.). В остром постишемическом периоде (1, 3 сут.) прежде всего появлялись структурные изменения, связанные с дисфункцией водно-электролитного и белкового обмена, приводящие к развитию цитотоксического отека-набухания (рис. 3, б, в). В наибольшей степени повреждались отростки фибриллярных астроцитов вокруг микрососудов, протоплазматических астроцитов и других структур нейропиля (синаптические терминали, мелкие дендриты). Необратимый распад нейронов сочетался с деструкцией митохондрий и разрушением цитомембран (рис. 3, в). Такие изменения нейронов являлись выражением быстрого фокального или тотального ишемического колликвационного некроза (развитие кариоцитолизиса, клетки-тени). Другие нейроны СМК, напротив, превращались в гиперхромные с различной степенью конденсации хроматина (рис. 3, г). Именно эти клетки были наиболее многочисленными, неоднородными по структуре и длительно сохранялись в постишемическом периоде. Общим для них явилось наличие электронно-плотного ядра и цитоплазмы. По ультраструктурным признакам выделяли несколько состояний гиперхромных нейронов: 1 — сниженной активности, 2 — дегенеративных (необратимых) изменений с исходом в коагуляционный некроз (пикноморфные нейроны) (рис. 4, а, б, в) и 3 — с исходом в апоптоз (рис. 4, г, д), а также 4 — с повышенной активностью и функциональным напряжением (рис. 5). Через 1 и 3 сут. после острой ишемии преобладали гиперхромные нейроны в состоянии сниженной биосинтетической активности, с признаками дегенеративных изменений. Через 7, 14, 21 и 30 сут. после острой ишемии — необратимо поврежденные пикноморфные нейроны, а также нейроны с признаками повышенной активности и функционального напряжения. В отдаленном постишемическом периоде (в сравнении с острым) в 2—3 раза увеличивалась доля нормохромных нейронов. То есть, тинкториальные свойства части гиперхромных нейронов восстанавливалась. В нейронах с снижением функциональной активностью, по сравнению с нормой, уменьшались размеры ядра и ядрышка, увеличивалось содержание гетерохроматина и отсутствовали интерхроматиновые гранулы, отмечалась выраженная осмиофилия кариоплазмы. Плотные ядрышки смещались на периферию ядра, неравномерно расширялись перинуклеарные пространства, появлялись складки поверхности ядра, многочисленные светлые митохондрии с разрушенными кристами, расширялись канальцы эндоплазматической сети (рис. 4, а). При этом эти нейроны сохраняли неповрежденные аксосоматические синапсы (рис. 4, е). Итогом тяжелого ишемического повреждения нейронов были коагуляционный некроз (пикноморфные нейроны) и апоптоз (рис. 4, в, д). Для пикноморфных нейронов характерно: выраженная осмиофилия ядра и цитоплазмы, уменьшение размеров тела клетки за счет сморщивания; деформация клеточного ядра, инвагинации; массивные скопления гетерохроматина под внутренней ядерной мембраной; фрагментация ядрышка и перемещение его частей к внутренней ядерной мембране; суженное перинуклеарное пространство; увеличенные размеров митохондрий, светлый матрикс и разрушение значительной части крист; плохо различимые канальцы эндоплазматической сети. Пикноморфные нейроны были окружены зоной отека-набухания астроцитарных отростков (рис. 4, в). Начальные проявления коагуляционно-ишемического некроза и апоптоза, из-за сходных ультраструктурных характеристик, очень сложно было отличить даже с помощью электронной микроскопии (рис. 4, б, г). Однако для ишемического коагуляционного некроза нейронов в большей степени были характерны такие ультраструктурные изменения, как набухание митохондрий, локальная коагуляция, гиперосмиофилия протеинов мембран, микротрубочек, крист митохондрий и цистерн эндоплазматической сети, конденсация хроматина ядра в плотные глыбки, увеличение в кариоплазме количества перихроматиновых гранул, уплотнение агрегированного хроматина и дезинтеграция ядрышка. От цистерн гранулярной эндоплазматической сети отделялись рибосомы, значительно расширялись цистерны оболочки ядра и эндоплазматической сети, отмечалась необратимая денатурация и коагуляция белков цитозоля, появлялись неструктурированные нерастворимые соединения (рис. 4, а, б, в). При коагуляционно-ишемическом отсроченном некрозе не выявлено признаков активации лизосом (рис. 4 а, б, в), а утилизация остатков погибших нейронов происходила длительное время с привлечением фагоцитов. Наиболее надежным дифференциальным критерием, отличающим коагуляционно-ишемический некроз от апоптоза в раннем постишемическом периоде, являлось морфологическое состояние ядра. При апоптозе в пикнотизированном ядре с гофрированными контурами ядрышко сохранялось (рис. 4, г). При коагуляционном некрозе наблюдали глубокий пикноз ядра с разрушением ядрышка (рис. 4, в). Абсолютным признаком программированной клеточной гибели было формирование апоптотических тел и разрушение цитолеммы (рис. 4, д). Кроме нормохромных и гиперхромных нейронов в отдаленном восстановительном периоде в СМК встречались гипохромные нейроны 7% (ДИ: 4,2—10,9%) с большим содержанием остаточных телец, поврежденными митохондриями, расширенными цистернами эндоплазматической сети, малым содержанием рибонуклеопротеинов в ядре (хроматина) и цитоплазме, неровными краями ядра. Вполне вероятно, что подобные изменения отражали функциональное истощение нейронов. Очень редко 3% (95% ДИ: 1,3—6%) встречались апоптозные клетки (рис. 4, г, д). Таким образом, после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий нами выявлены реактивные тинкториальные, гидропические дистрофические и некробиотические (колликвационные и коагуляционные) изменения, а также структурные признаки апоптоза. Максимальной активности механизмы апоптоза достигали через 3 сут. после острой ишемии. За счет апоптоза ОЧП нейронов СМК уменьшалась на 9-17%. В отдаленном восстановительном периоде (14, 21 и 30 сут.) часть не сморщенных гиперхромных и нормохромных нейронов имела признаки активного функционирования и напряжения (транскрипционной активности). У этих нейронов отмечалась высокая электронная плотность ядер, неровность их контуров, очаговые скопления интерхроматиновых гранул и перихроматиновых фибрилл на фоне светлого эухроматина. Ядрышки этих нейронов увеличивались в размере, располагались эксцентрично, содержали гранулярные компоненты. Краевой хроматин ядра был представлен небольшими скоплениями под внутренней ядерной мембраной, фрагментарно расширялось перинуклеарное пространство, отмечались складки ядерной мембраны. В перинуклерной зоне цитоплазмы выявлено большое количество темных неповрежденных митохондрий. В некоторых клетках наблюдалось очаговое расширение канальцев эндоплазматической сети, увеличение плотности свободных рибосом, гипертрофированный комплекс Гольджи, мультивезикулярные и мультиламинарные тела (рис. 5). Следовательно, структурная организация части нормохромных и гиперхромных нейронов (в состоянии активации и напряжения) указывала на высокую интенсивность протекающих в них транскрипционных процессов (в клеточном ядре) и белоксинтетических процессов (в цитоплазме — внутриклеточная регенерация и компенсаторная гиперплазия). Вероятно, именно за счет подобных нейронов происходило восстановление функций поврежденного головного мозга в отдаленном постишемическом периоде. По данным литературы, динамика, основные фазы и направления структурно-функциональных изменений нейронов головного мозга белых крыс после острой ишемии остаются актуальными проблемами нейроморфологии. Изучение структурных механизмов повреждения нейронов в постишемическом периоде неизбежно сталкивается с необходимостью верификации некроза и апоптоза. Существует множество различных методов, которые позволяют визуализировать различные признаки постишемической гибели клеток. Однако наиболее надежным методом, способным однозначно различать некроз и апоптоз, является детальный анализ клеточной ультраструктуры с помощью электронной микроскопии. Поэтому в настоящее время многие авторы рекомендуют делать акцент на детальном описании морфологической картины патологически измененных клеток. Наряду с иммуногистохимией, TUNEL- и ISEL-методами это позволяет избежать искажения интерпретации морфометрических результатов и наиболее точно дифференцировать «апоптоз» и «некроз». Необходимо учитывать, что механизмы, посредством которых нейроны погибают и восстанавливаются при ишемии очень сложны и до конца не изучены. Согласно рекомендациям Nomenclature Committee on Cell Death (2009), смерть клетки может быть классифицирована на основе морфологического внешнего вида (некроз, апоптоз, аутофагия и различные смешанные фенотипы), но только тогда, когда доказаны: 1 — потеря целостности плазматической мембраны, 2 — полный распад клетки, включая ее ядро, или 3 — фагоцитоз фрагментов или клетки в целом. При этом иммуногистохимические маркеры апоптоза играют вспомогательную роль. К сожалению, несмотря на огромный объем информации, «точка невозврата» и направление гибели при оценке состояния конкретных гиперхромных нейронов после острой ишемии до сих пор не определены и нет простых решений этих проблем. В большинстве случаев при анализе морфологических данных можно судить только о вероятности появления некроза или апоптоза для конкретного гиперхромного нейрона. В настоящей работе проведено детальное описание всех морфотипов измененных пирамидных нейронов СМК белых крыс после острой 20-минутной ишемии с помощью световой, флуоресцентной (DAPI) и электронной микроскопии. Сочетанное использование методов позволило классифицировать нейроны и, при наличии четких структурных маркеров (распад ядер, клетки, фагоцитоз) доказать возможность апоптоза гиперхромных нейронов СМК после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий. При окраске DAPI фрагментированные апоптозные ядра отчетливо выявлялись в виде типичных групп, близко расположенных плотных флуоресцирующих телец ДНК-содержащего материала, что позволяло их легко идентифицировать. Наиболее надежным критерием, отличающим коагуляционно-ишемический некроз от апоптоза в раннем постишемическом периоде, являлось морфологическое состояние ядра, а абсолютным признаком программированной клеточной гибели является формирование апоптотических тел и разрушение цитолеммы. Например, на основании подобного подхода, в слое III через 3 сут. показано, что 5,8—13,3% гиперхромных нейронов подвергалось апоптозу, 13,9—23,9% — коагуляционному некрозу, а остальные выходили из патологического состояния в отдаленном восстановительном периоде. Необратимо измененные клетки-тени составляли 7,8—16,1%. В результате общая численная плотность пирамидных нейронов в течение 30 сут. постишемического периода в слое III СМК снижалась на 24,9—36,6%, а в слое V — на 10,3—19,4%. Ранее близкие значения показаны в процессе формирования очага ишемического инсульта после полной локальной ишемии в зоне пенумбры. Заключение. Таким образом, при использовании 2-сосудистой модели неполной глобальной ишемии без гипотонии была доказана смешанная природа гибели нейронов в СМК — одновременное сочетание процессов некроза и апоптоза (парапоптоз). Однако основную роль в гибели нейронов все же играли процессы быстрого и отдаленного ишемического некроза. Полученные результаты могут быть полезны при изучении динамики, основных фаз и направлений структурно-функциональных изменений нейронов неокортекса млекопитающих при сравнении разных экспериментальных моделей острой ишемии головного мозга, а также для понимания структурных основ патогенеза постишемической энцефалопатии.

Авторы:

Издание: Патологическая физиология и экспериментальная терапия
Год издания: 2018
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.30-38. Библ. 22 назв.
Просмотров: 49