Нейропротективный и антиамнестический эффекты комбинированной терапии при ишемическом повреждении префронтальной коры в эксперименте

Аннотация:

Цель исследования — изучение влияния комбинированной терапии (мутантные молекулы эритропоэтина (ЕРО) и дипептидный миметик фактора роста нервов ГК-2Н) на воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) и объем поражения коры мозга у крыс с двусторонним ишемическим повреждением префронтальной коры. Методика. Мутантные молекулы ЕРО (MEPO-TR и MEPO-Fc) с значительно редуцированной эритропоэтической и выраженной цитопротекторной активностью созданы методом генной инженерии. Используемый миметик фактора роста нервов человека, эндогенного регуляторного белка, в экспериментах in vitro проявлял отчетливые нейропротективные свойства. Двустороннюю фокальную ишемию префронтальной коры головного мозга крыс создавали методом фотохимического тромбоза. Выработку и оценку УРПИ проводили по стандартной методике. Объем повреждения мозга оценивался при помощи MPT. MEPO-TR и MEPO-Fc (50 мкг/кг) вводили интраназально однократно через 1 ч после фототромбоза, ГК-2Н (1 мг/кг) — внутрибрюшинно через 4 ч после фототромбоза и далее в течение 4 послеоперационных суток. Результаты. Выявлено статистически значимое сохранение выработанного до ишемии УРПИ, а также значимое снижение объема повреждения коры при комплексной терапии. Полученные данные свидетельствуют об антиамнестическом и нейропротекторном эффектах примененной комбинированной терапии, которые наиболее отчетливо выражены в дозах: MEPO-Fc (50 мкг/кг) и ГК-2Н (1 мг/кг). Заключение. Подтвержден нейропротекторный эффект и усиление антиамнестического эффекта при сочетанном применении мутантных производных эритропоэтина — MEPO-TR и MEPO-Fc и дипептидного миметика фактора роста нервов человека ГК-2Н. Ключевые слова: мутантные молекулы эритропоэтина; дипептидный миметик фактора роста нервов ГК.-2Н; фототромбоз; кора; нейропротекция; крысы. Введение. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, инсульт занимает второе место среди причин смертности населения. Вместе с ишемической болезнью сердца, инсульт в 2015 г. унес в общей сложности 15 млн жизней. Ежегодная смертность от инсульта в РФ оценивается как 374 на 100 тыс. населения. При этом в так называемый острый период инсульта, составляющий в среднем 21 сут. с момента его развития, летальность достигает 35%, а в течение года погибает еще 15% из выживших пациентов. Разработка новых схем патогенетической терапии ишемического инсульта позволит снизить летальность и повысить эффективность функционального восстановления пациентов. Известно, что основными стратегическими направлениями специфической терапии инсульта являются: реперфузия — восстановление мозгового кровотока, профилактика тромбообразования и нейропротекция — поддержание метаболизма и защита ткани мозга от повреждений. Использование препаратов нейрометаболического действия повышает устойчивость нейронов в условиях недостаточности кровоснабжения и кислородного голодания. В связи с этим, поиск новых лекарственных препаратов с возможным нейропротективным эффектом остается одной из важнейших задач современной медицины. Прогресс в определении механизмов нейродегенерации способствует выявлению новых фармакологических мишеней для разработки эффективных средств патогенетической фармакотерапии. Подходы к созданию таких препаратов базируются на современных представлениях о механизмах эндогенного регулирования функций нейронов и их регенерации. Накоплены обширные сведения о цитокинах — молекулах, являющихся посредниками межклеточных взаимодействий, регулирующих кроветворение, иммунный ответ, клеточный цикл в разных тканях, участвующих во многих физиологических и патологических процессах. Один из них — гемопоэтический ростовой фактор эритропоэтин (ЕРО). Помимо регуляции эритропоэза, ЕРО проявляет широкий спектр защитных функций в организме. Особое внимание уделяется изучению производных эритропоэтина, не стимулирующих эритропоэз, но способных инициировать цитопротекцию. Методом генной инженерии созданы мутантные молекулы ЕРО, несущие замену (R103A), как в виде мономера EPO-TR, так и димера в форме рекомбинантного белка с Fc-фрагментом иммуноглобулина, сформированного за счёт димеризации двух Fc-фрагментов. Эритропоэтическая активность полученных мутантных гибридных белков оценена в тестах in vitro, где производилось исследование способности очищенных мутантных белков инициировать пролиферацию UT-7epo клеток, чувствительных к ЕРО в сравнении со стандартным препаратом ЕРО. Анализ полученных данных показал, что способность взаимодействовать с рецептором и соответственно вызывать пролиферацию UT-7epo клеток, редуцирована в 1000 и более раз у мутанта, содержащего замену R103E в контексте мономера ЕРО. В случае димерных молекул с молекулой Fc, способность вызывать пролиферацию была снижена в 100 раз. Таким образом, созданы мутантные молекулы эритропоэтина в контексте EPO-TR и EPO-Fc с сильно редуцированной эритропоэтической активностью. Среди известных эндогенных регуляторных белков особое внимание уделяется факторам роста нервной ткани (ФРНТ), в частности, нейротрофинам и среди них — фактору роста нервов (ФРН, nerve growth factor, NGF). ФРН участвует в росте, созревании и поддержании жизнедеятельности нейронов в центральной и периферической нервной системе как в норме, так и в патологии. С момента открытия ФРН способность нейротрофинов предотвращать дегенерацию нейронов, стимулировать их регенерацию, повышать синаптическую пластичность, исследованная на различных моделях in vitro и in vivo, открыла перспективу их использования в качестве основной или вспомогательной терапии при ряде заболеваний, сопровождающихся неиродегенеративными процессами. В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» сконструирован и синтезирован миметик фактора роста нервов человека (human) на основе (3-изгиба четвертой петли, представляющий собой димерный замещенный дипептид гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-глицил-лизина) ГК-2 human (ГК-2Н). В экспериментах in vitro у соединения выявлены нейропротективные свойства. Практически важной задачей является изучение влияния комплексной терапии с использованием мутантных молекул эритропоэтина MEPO-TR, ME-PO-Fc и дипептидного миметика человеческого фактора роста нервов ГК-2Н на нарушения поведения и объем повреждения при ишемическом фотохимическом тромбозе префронтальной коры головного мозга крыс. Цель исследования — изучение влияния комбинированной терапии, включающей мутантные молекулы эритропоэтина и дипептидный миметик человеческого фактора роста нервов ГК-2Н на воспроизведение условного рефлекса пассивного избегания и объем поражения мозга у крыс с ишемическим повреждением префронтальной коры. Методика. Работа выполнена на 50 нелинейных крысах-самцах массой 200—220 г, выращенных в виварии ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии». Животные содержались при свободном доступе к пище и воде и 12-часовом световом режиме. Все эксперименты проводились в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденными МЗ РФ №708 от 23.08.2010 г. и одобрены этическим комитетом НИИОПП. Введение мутантных молекул эритропоэтина — MEPO-TR и MEPO-Fc осуществлялось интраназально (и/н) однократно в дозе 50 мкг/кг через 1 ч после воспроизведения фототромбоза префронтальной коры. Дипептидный миметик ГК-2Н вводили внутрибрюшинно (в/б) в дозе 1 мг/кг по схеме: через 4 ч после двустороннего фототромбоза и далее в течение 4-х послеоперационных сут. Все экспериментальные животные были разделены на 5 групп: 1.Фототромбоз + ГК-2Н в дозе 1 мг/кг в/б (п=10); 2.Фототромбоз + MEPO-TR в дозе 50 мкг/кг и/н + ГК-2Н в дозе 1 мг/кг в/б (п=10); 3.Фототромбоз + MEPO-Fc в дозе 50 мкг/кг и/н + ГК-2Н в дозе 1 мг/кг в/б по схеме (п = 10); 4. Ложнооперированный контроль (п=10); 5.Фототромбоз + 0,9% раствор NaCl в объеме 50 мкл (п=10). Двусторонний фокальный ишемический инфаркт префронтальной коры головного мозга крыс — поля Frl и Fr2 создавали методом фотохимически индуцируемого тромбоза. Операцию проводили под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг). После введения фотосенсибилизирующего красителя бенгальского розового («Sigma», USA; 40 мг /кг, внутривенно) крысу фиксировали в стереотаксисе, делали продольный разрез кожи и удаляли надкостницу. Для облучения использовали специальную установку, состоящую из источника холодного света — галогеновой лампы мощностью 250 Вт и световода с диаметром внутреннего сечения 3 мм. Световод устанавливали на расстоянии 1 мм от поверхности черепа, на 2 мм ростральнее брегмы и на 2 мм латеральнее сагиттального шва и облучали через кости черепа каждое из полушарий мозга холодным светом длиной волны 560 nm в течение 15 минут с каждой стороны. Ложнооперированные животные подвергались тем же манипуляциям, за исключением введения красителя бенгальского розового. Условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ) вырабатывали по ранее описанной схеме. Определяли латентный период (АП) — время, которое проходило от начала тестирования до момента Пересечения крысой отверстия, разделяющего освещенный и темный отсеки камеры. В 1-е сут. обучения крысу помещали в освещенный отсек, обследовав который она через некоторое время (АП до обучения) переходила в темный отсек, после чего дверь закрывали и оставляли там крысу на 5 мин. Через 1 ч процедуру повторяли, но крысу сразу извлекали из темного отсека. На 2-е сут. эту же процедуру повторяли дважды с интервалом в 1 ч. При повторном заходе крысы в темный отсек камеры дверь в него закрывали и через металлические прутья пола пропускали электрический ток (1,3 мА, 50 Гц, 5 с). УРПИ считали выработанным, если лп составлял не менее 300 С. Животных с меньшим АП исключали из эксперимента. Оценку АП УРПИ проводили на 4-е сут. после фотохимического тромбоза префронтальной коры. Объем повреждения головного мозга экспериментальных животных оценивали при помощи магнитно-резонансной томографии (МРТ) на 4-е сут. после фототромбоза. Животные были предварительно наркотизированы внутрибрюшинным введением хлоралгидрата (300 мг/кг). Сканирование головного мозга производилось на магнитно-резонансном томографе BioSpec 70/30 USR фирмы Bruker (Germany) с постоянным магнитным полем 7Тл и с градиентной системой 105мТл/м. Морфометрический анализ МРТ-изображений проводили в программе ImageJ 1.38х (National Institutes of Health, USA). Статистическую обработку данных осуществляли с использованием компьютерной программы Statistica 6.0. Для сравнения показателей латентного периода в тесте УРПИ использовали U-критерий Манна—Уитни для независимых выборок и критерий Вилкоксона для связанных выборок. Статистическую значимость различий объемов инфаркта оценивали по t-критерию Стьюдента. Результаты и обсуждение. В предыдущих работах нами показано, что двусторонний тромбоз кровеносных сосудов префронтальной области коры головного мозга крыс приводит к формированию ишемического очага, который захватывает всю толщу коры и отделен от окружающей неповрежденной ткани четко выраженной границей, такое повреждение коры сопровождается потерей выработанного до ишемии условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). При однократном интраназальном введении мутантных производных эритропоэтина (50 мкг/кг) через 1 ч после операции совместно с внутрибрюшинным введением дипептидного миметика ГК-2Н в дозе (1 мг/кг) и далее по схеме, АП УРПИ на 4-е сут. после ишемии составил 300 с в группе, получавшей MEPO-Fc+rK-2H, достигнув дооперационного показателя и 288 с в группе с MEPO-TR+rK-2H. АП УРПИ животных, получавших ГК-2Н составил 245 с, у контрольной группы с NaCl 0,9% этот показатель составил 68 с (рисунок). Стоит отметить, что рассчитанный коэффициент эффективности защиты (табл. 1) оказался самым высоким при введении MEPO-Fc (50 мкг/кг) + ГК-2Н (1 мг/кг) по схеме и составил 100%, несколько ниже — 94% при введении комплекса MEPO-TR (50 мкг/кг) + ГК-2Н (1 мг/кг) по схеме, что оказалось статистически значимо выше коэффициента защиты при монотерапии мутантными производными эритпропоэтина — по 56% ДЛЯ MEPO-Fc (50 мкг/кг) И MEPO-TR (50 мкг/кг) соответственно и существенно выше этого показателя у ГК-2Н — 73%. Полученные данные показали статистически значимое сохранение выработанного до ишемии УРПИ, как при введении ГК-2Н, что было подтверждено ранее, так и при комплексной терапии, что свидетельствует о высокой антиамнестической эффективности этих комбинаций. МРТ-исследование показало (табл. 2), что суммарный объем поражения мозга крысы при фототромбозе составил 29,1 мм3. Во всех трех опытных группах животных, получавших как ГК-2Н, так и MEPO-TR + ГК-2Н, MEPO-Fc + ГК-2Н наблюдалось статистически значимое снижение объема повреждения, что соответствовало значениям при монотерапии MEPO-Fc и MEPO-TR в дозе 50 мкг/кг, полученным ранее и указывает на нейропротекторный эффект комбинированной терапии. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженном антиамнестическом, а также нейропротекторном эффектах комбинированной терапии, которые наиболее отчетливо выражены при введении комплекса MEPO-Fc (50 мкг/кг) + ГК-2Н (1 мг/кг) по схеме. Ряд работ свидетельствует об участии ФРН (NGF) в механизме повреждений при инсультах. Показано, что острая ишемия головного мозга сопровождается увеличением экспрессии мРНК NGF, содержания неиротрофина в коре, что может быть связано с его защитной функцией от гибели нейронов. Была установлена статистически значимая обратная зависимость между размерами сформированного к 5-м — 7-м сут. инфаркта мозга и уровнем NGF в 1-е сут. Эти факты подтверждают участие NGF в компенсаторных механизмах, противодействующих гибели нейронов. Клинические исследования свидетельствуют о том, что NGF эффективен в 1-е сут. после инсульта, т.к. объем инфаркта и выраженность неврологических нарушений зависят от содержания эндогенного NGF именно в этот период. ЕРО и рецептор к нему экспрессируются в центральной и периферической нервной системе, принимая активное участие в эмбриональном развитии человека, а также в защите мозга взрослых от повреждений. При периферическом введении рекомбинантный ЕРО оказывает выраженное протекторное действие на поврежденную церебральную ткань через активацию антиапоптотических генов, запуская антиоксидантные и противовоспалительные механизмы в нейронах, глиальных и цереброваскулярных эндотелиальных клетках, стимулируя ангио- и нейрогенез. Вместе с тем, в связи с малой способностью ЕРО проникать через гематоэнцефалический барьер эти свойства препарата выявляются только в дозах, в 20—100 раз превышающих терапевтические, что часто приводит к развитию нежелательных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы. В наших предыдущих работах было показано, что мутантные формы эритропоэтина, лишенные эритропоэтической активности, как в контексте мономера, так и в контексте димера (MEPO-TR, MEPO-Fc), обладают нейропротекторными свойствами даже при уменьшении дозы введения на модели фокальной церебральной ишемии. ГК-2Н также показал ней-ропроотекторное и антиамнестическое действие на модели экспериментальной ишемии. По мнению ряда авторов, одним из механизмов нейропротекторного действия эритропоэтина является активация генов нейротрофинов, а именно BDNF и NGF. Помимо этого было показано, что наносомальная форма рекомбинантного эритропоэтина значительно увеличивает уровень мРНК BDNF и NGF в фронтальной коре и гиппокампе крыс, что подтверждает эту гипотезу. Установлено, что дипептидный миметик фактора роста нервов, обладая нейропротективной активностью, действует по NGF-пoдобному механизму. Учитывая полученные нами данные по снижению объема повреждения при комбинированной терапии, сопоставимые с результатами при монотерапии каждым из препаратов, можно предположить, что мутантные производные эритропоэтина и дипептидный миметик человеческого фактора роста нервов действуют однонаправленно, возможно, активируя одни и те же рецепторы. Выраженный антиамнестичский эффект, по-видимому, обусловлен стабилизацией баланса между ингибирующей и активирующей нейрональной активностью в структурах, ответственных за память. Заключение. Результаты данного исследования показали нейропротекторный эффект комбинированной терапии и усиление антиамнестического эффекта при сочетанном применении мутантных производных эритропоэтина — MEPO-TR и MEPO-Fc и дипептидного миметика человеческого фактора роста нервов ГК-2Н. Можно предположить, что комбинированная терапия в период формирования очага ишемического поражения (первые 4 ч), а также в течении 4-х постоперационных сут. интенсивно противодействует гибели нейронов.

Авторы:

Издание: Патологическая физиология и экспериментальная терапия
Год издания: 2018
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.39-45. Библ. 31 назв.
Просмотров: 54