Ангиогенная витализация биосовместимого и биодеградируемого матрикса (экспериментальное исследование in vivo)

Аннотация:

Цель исследования — оценка влияния на ангиогенез конструкций из волокнистого поликапролактона, модифицированного плазмидой с геном сосудистого фактора роста, при имплантации крысам. Методика. Эксперименты выполнены на 24 крысах-самках Вистар в возрасте 2 мес, массой 180—200 г. В работе исследовали плоские каркасы размером 1 см X 1 см, полученные методом эмульсионного электроспиннинга из раствора поликапролактона. Материал каркасов витализировали плазмидой VEGF-165 (геннотерапевтический препарат Неоваскулген), введенной внутрь двух типов волокнистых материалов в разных концентрациях: низкой — 0,005 мг/мл, и высокой — 0,05 мг/мл. Образец и контроль (материал без витализации) одномоментно имплантировали подкожно в два сформированных симметричных кармана в межлопаточной зоне. Окружающие каркас ткани на 7-е, 16-е, 33-и, 46-е и 64-е сутки извлекали, проводили гистологическое исследование: изучали тканевую реакцию с морфометрической оценкой плотности распределения и диаметра сосудов в области имплантации, а также оценивали степень биодеградации волокнистого материала. Результаты. Признаков тканевой реакции отторжения при имплантации как контрольного, так и модифицированного материала не выявлено. Показано, что при экспозиции материала in vivo наряду с резорбцией материала происходят изменения количества и диаметра сосудов. Выявлен дозозависимый эффект стимуляции ангиогенеза при увеличении концентрации Неоваскулгена в образцах. Для витализированных материалов отмечено увеличение плотности распределения сосудов на 46% (высокая концентрация, 33-и сут) по сравнению с контролем. После прекращения воздействия препарата, плотность распределения сосудов приближалась к значениям в контроле. Заключение. Разработанная методика витализации полимерных каркасов с внесением раствора геннотерапевтического препарата Неоваскулген внутрь микроволокон обеспечивает пролонгированный и дозозависимый эффект на рост сосудов в зоне имплантации. Ключевые слова: ангиогенез; биосовместимые материалы; васкуляризация; витализация; ген-активированный материал; Неоваскулген; поликапролактон; тканевая инженерия; электроспиннинг; функционализация биоматериала. Введение. Недостаточная васкуляризация зоны имплантации искусственных материалов — одна из важнейших причин развития ишемии, фиброза, бактериального инфицирования и некроза тканей вокруг трансплантата. С целью предотвращения нежелательных последствий и стимулирования нормального роста тканей применяется активация зоны имплантации биологически активными соединениями (БАС). Проблема целевой доставки таких молекул является одной из ключевых проблем современной прецензионной медицины, решением которой служит разработка специальных средств и методов, в том числе основанных на принципах клеточной хемо- и механорецепции. Одним из вариантов пролонгации действия препаратов является биологическая активация трансплантата, изготовленного из нативных или искусственных материалов. Ангиогенная витализация — модификация естественного или искусственного материала с целью стимулирования роста сосудов в зоне имплантации, предотвращения развития послеоперационных осложнений и обеспечения миграции клеток в соответствующие ниши, например, при имплантации ген-активированных материалов или витализированных тканеинженерных конструкций. Ранее было показано, что использование белковых факторов роста (bFGF, EGF, VEGF, PDGF и др.) при местном введении, осаждении на поверхности материала или размещении в объеме биодеградируемого материала способствует росту сосудов в зоне имплантации. При этом подчеркиваются преимущества пролонгированного высвобождения БАС из структуры полимера по сравнению с местным введением или абсорбцией на поверхности материала. В качестве материалов-носителей БАС используются гидрогели, поликапролактон (ПКЛ), полимолочная кислота, и другие полимеры и сополимеры. Выбор материала для модификации имеет значение из-за различий в биосовместимости и сроках биодеградации, что оказывает влияние на сроки и темпы выхода БАС из структуры материала при имплантации. Использование белковых молекул имеет ряд недостатков, таких как видоспецифичность и иммуногенность, поэтому использование соединений на основе неиммуногенных молекул (например, нуклеиновых кислот) является перспективным направлением модификации биосовместимых имплантов. Например, генотерапевтический препарат на основе плазмиды VEGF165 используется для стимулирования терапевтического ангиогенеза при ишемии нижних конечностей. Биологическая стимуляция роста сосудов, использованная в настоящей работе, основана на спонтанной трансфекции плазмид в клетки. В литературе обсуждаются возможные молекулярные механизмы проникновения в клетки плазмидных конструкций, несущих ген ангиогенного фактора VEGF. Плазмида с встроенным терапевтическим геном преодолевает плазматическую мембрану клетки посредством эндоцитоза или гидропорации, и не вызывает иммунологической реакции. Ранее были известны способы активации поверхности материала плазмидои VEGF, но работ по внедрению плазмид в структуру материала с целью их пролонгированного высвобождения известно не было. Цель исследования — оценка влияния на ангиогенез конструкций из волокнистого поликапролактона, витализированного плазмидой с геном сосудистого фактора роста, при имплантации крысам. Методика. Биосовместимый материал. Конструкции размером 1 см X 1 см и толщиной 500 ± 15 мкм изготовлены из волокнистого поликапролактона (ПКЛ) в НИЦ «Курчатовский институт» методом эмульсионного электроформования. Диаметр полученных волокон составлял 2—3 мкм. Материалы из ПКЛ относят к биосовместимым и биорезорбируемым. В процессе электроформования по разработанной нами методике в волокнистые материалы были внедрены образцы препарата «Неоваскулген» (НВГ) в двух концентрациях: низкой (НКп) — 0,005 мг/мл, и высокой (ВКп) — 0,05 мг/мл. Ранее по данной методике нами были получены конструкции из ПКЛ, содержащие белковый эпидермаль-ный фактор роста. Препарат НВГ представляет собой ДНК-плазмиду pI-VEGF165 (регистрационное удостоверение Росздравнадзора № ЛП-000671 от 28.09.2011). В качестве контроля использовалась имплантация конструкций без НВГ. Животные. Опыты выполнены на 24 крысах-самках Вистар исходной массой 180—200 г в возрасте 2 мес. из питомника «Андреевка» НЦ «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» (пос. Светлые Горы, МО) и содержавшихся в Центральном виварии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова при свободном доступе к пище и воде и естественной смене светового режима. Этическая экспертиза. Содержание животных и манипуляции с ними проводили в соответствии с требованиями законодательства об этике проведения экспериментальных исследований на животных, одобренными Локальным этическим комитетом Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Все экспериментальные работы выполнены с соблюдением утвержденных Европейской конвенцией правил биоэтики о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях и Правилами лабораторной практики, утвержденными приказом МЗ РФ № 708 от 23.08.2010 г. Под анестезией с помощью ветеринарных препаратов «Золетил 100» (Virbac, Франция) и «Рометар» (Bioveta, Чехия) в стерильных условиях производили рассечение кожи в межлопаточной области крыс с последующим внедрением и фиксацией каркасов в подкожную клетчатку, после чего операционную рану зашивали наглухо. В сроки на 7-е, 16-е, 33-и, 46-е и 64-е сут. животных декапитировали под хлороформным наркозом. Окружающие каркас ткани извлекали, фиксировали в 10%-м нейтральном растворе формалина, подвергали стандартной обработке для последующего морфологического исследования. Морфологические исследования. Парафиновые срезы толщиной 4 мкм изготавливали на микротоме Microm НМ 355s (Thermo Fisher Scientific, США), окрашивали гематоксилином и эозином. Оцифрованные изображения срезов высокого разрешения получали при помощи сканирующей системы Pannoramic DESK (3DHistech Ltd., Венгрия). Биосовместимость. Ранее нами было показано отсутствие цитотоксичности волокнистого ПКЛ без витализации in vitro. Биосовместимость материала оценивали на окрашенных гематоксилин-эозином образцах: качественно оценивали количество иммунных клеток в области имплантации материала, токсичность определяли по количеству нейтрофилов. Деструкцию материала оценивали по изменению количества макрофагов и гигантских клеток инородных тел (ГКИТ) в образце. Биодеградируемость. Поскольку волокнистый материал растворялся при пробоподготовке образцов, то степень резорбции материала (Ат/Аобщ) подсчитывали косвенно, как отношение площади материала (белые области) к общей площади поля зрения. Параметры определяли в области имплантации при увеличении х10 в программе Pannoramic Viewer. Ангиогенез. Плотность распределения и долю крупных сосудов в области резорбции имплантированного материала подсчитывали вручную слепым методом совместно с сотрудниками лаборатории экспериментальной морфологии Первого МГМУ им. Сеченова. Плотность сосудов оценивали на микрофотографиях как количество сосудов на 1 мм2 зоны наблюдения. Крупными считали сосуды диаметром более 15 мкм. Количество и размер сосудов подсчитывали в 5 полях зрения диаметром 600 мкм каждое в программе Pannoramic Viewer v. 1.15.4. Статистика. Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики при помощи компьютерной программы GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., США). Выборки проверяли на нормальное распределение по критерию Шапиро—Уилка, после чего выявляли влияние исследуемого препарата на количество сосудов методом одно-факторного дисперсионного анализа (One-way ANOWA) с апостериорным анализом Тьюки. Различия считали значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Результаты и обсуждение. Биосовместимость материала. Морфологическое изучение гистологических препаратов экспериментального материала показало отсутствие на всех сроках признаков инфильтрации иммунными клетками, а именно наличия нейтрофилов, лимфоцитов и плазмоцитов. Отмечено присутствие в ткани гигантских многоядерных клеток инородных тел. Отсутствие воспалительной реакции и признаков отторжения материала свидетельствует о минимальной цитотоксичности материала в условиях in vivo. Биодеградируемость материала. Отмечалось постепенное уменьшение видимого материала вследствие его фрагментации и резорбции в зонах сосудистого роста. Если на 7-е сут. материал составлял 40% видимой зоны, то на 64-е сут. его доля снизилась до 15% (Рис. 1). Ангиогенез (размеры и плотность распределения сосудов). Проведено исследование образцов (тканевый лоскут с частично деградировавшим имплантированным каркасом) на сроках 7-е, 16-е, 33-и, 46-е и 64-е сут. Гистологическая картина по срокам изменений в образцах представлена на рис. 2 и 3. Материал на 7-е сут. наблюдения описывали только качественно (без подсчета числа сосудов) ввиду слаборазвитой в эти сроки ткани вокруг сохранных волокон имплантированной конструкции. Около 80% матрикса не фрагментировано, сосуды, в основном, находятся на периферии сохранного матрикса (рис. 2). На 16-е сут. 25% матрикса подверглось резорбции, среди формирующейся в зоне резорбции матрикса грануляционной ткани наблюдается сформированная сосудистая сеть (сосуды капиллярного типа). На 33-и сут. наряду с сосудами капиллярного типа появляются крупные сосуды. Грануляционная ткань вокруг волокон материала хорошо развита (рис. 3), на сроках 46—64 сут. она превращается в зрелую соединительную ткань. В образцах на 46-е и 64-е сут. матрикс из ПКЛ практически полностью фрагментирован. Не выявлено различий в образцах по сравнению с контролем плотности распределения сосудов. В таблице представлены данные о плотности распределения сосудов в контрольных образцах и образцах при имплантации матриксов с различной концентрацией НВГ. На 16-е сут. отмечено увеличение плотности распределения сосудов в группах ВКп и НВп по сравнению с контролем (на 17%, р<0,05), что объясняется выходом БАС из структуры полимера. Поскольку БАС находились в объеме полимера, то их выход носил отсроченный характер. На 33-и сут. отмечено уменьшение общей плотности распределения сосудов в контрольной группе вследствие смены этапа васкулогенеза (капилляры диаметром менее 15 мкм) на нормальный ангиогенез, однако на этом фоне в группе с ВКп плотность распределения сосудов на 46% (р<0,001) превысила значения в контроле, что может объясняться выходом НВГ из объема резорбирующего волокнистого поликапролактона. Полученные результаты согласуются с работами других авторов, изучавших ангиогенную модификацию матриксов. Так, в работе по изучению влияния белкового фактора bFGF на локальный ангиогенез, отмечалось увеличение на 35% плотности распределения сосудов по сравнению с имплантацией контрольного коллагенового матрикса. Использование преваскуляризированных трансплантов из альгината показало увеличение плотности сосудов более чем в 2 раза на 7-е сут. имплантации. При этом пик васкуляризации приходился на 10-й сут. Изучение показателей роста сосудов в контрольной группе выявило увеличение плотности распределения сосудов со временем (рис. 4, А), что полностью согласуется с данными других авторов об этапности сосудообразования in vivo. В группе сравнения наблюдалась та же закономерность, при этом на 33-и сут. в группе с высокой концентрацией НВГ плотность распределения сосудов была статистически значимо выше, чем в контроле и образцах с низкой концентрацией НВГ. Доли крупных сосудов в контрольной группе и в группах сравнения были схожи, при этом на 33-и сут. наблюдались максимальные различия в группах высокой и низкой концентрации НВГ (рис. 4, Б). Известно, что новообразованные соматические капилляры (васкулогенез) имеют диаметр до 10—15 мкм, а дальнейшее их развитие — (ангиогенез) регулируется множеством цитокинов, ростовых факторов, а также характером взаимодействия эндотелиальных клеток друг с другом, с компонентами экстрацеллюлярного матрикса и с клетками микроокружения. Лишь спустя некоторое время, происходит образование «взрослых» сосудов, «схлопывание» локальных зон микрососудов и таким образом — общее уменьшение локальной плотности распределения сосудов. Это же мы наблюдали при изучении морфологии препаратов в контроле — в период с 16-х до 64-х сут. наблюдалось изменение процентного соотношения сосудов большого диаметра (более 15 мкм). На 46-е и 64-е сут. параллельно с биорезорбцией полимерных волокон матрикса (разрушение и фрагментация волокнистого материала), наблюдалось сглаживание различий в группах по сравнению с контролем, обусловленное «схлопыванием» микрососудов, образованных во время начального васкулогенеза, при прекращении воздействия факторов, стимулирующих сосудообразование (рис. 4,А). Показано, что витализация биосовместимых и биодеградируемых каркасов геннотерапевтическим препаратом возможна с тем же физиологическим эффектом, что и при использовании рекомбинантных белковых факторов роста. Ранее исследователями было показано, что рецепторы VEGF играют значимую роль в прогнозе и терапии заболеваний, протекающих с выраженными нарушениями ангиогенеза, решением которой могут быть тканеинженерные конструкции — носители кодирующих нуклеиновокислотные последовательности ростовых факторов васкуляризации. Таким образом, полученные данные показали статистически значимое увеличение плотности распределения сосудов в зонах имплантации каркасов из поликапролактона, модифицированных введением генно-терапевтического препарата на основе нуклеиновой кислоты внутрь волокон биосовместимого материала. Отмечено увеличение плотности распределения сосудов на 46% при высвобождении БАС. Результаты согласуются с данными других авторов, которые продемонстрировали возможность использования БАС — двуцепочечных ДНК-плазмид как альтернативы белковым факторам, без выраженного цитотоксического эффекта. Показано дозозависимое влияние на васкуляризацию и ангиогенез при увеличении концентрации препарата «Неоваскулген» в материале. При этом эффект является обратимым, и при прекращении выхода препарата из резорбированного матрикса, плотность распределения сосудов приближается к значениям в контроле. Результаты продемонстрировали эффективность ангиогенной витализации матриксов на основе биосовместимых и биодеградируемых материалов для обеспечения физиологической и биологической совместимости трансплантатов.

Авторы:

Издание: Патологическая физиология и экспериментальная терапия
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.53-60. Библ. 18 назв.
Просмотров: 48