Изменения экспрессии IL-4 и IFN-y в моноцитах и Т-лимфоцитах-хелперах при моделировании системного ювенильного идиопатического артрита у крыс Wistar

Аннотация:

Цель исследования — изучение перепрограммирования мононуклеарных лейкоцитов на модели системного ювенильного идиопатического артрита (сЮИА), воспроизводимой у крыс Wistar с использованием полного адъюванта Фрейнда и липополисахарида. Методика. сЮИА воспроизведен у 6-месячных крыс-самцов Wistar. На 40-е сут. эксперимента животные были разделены на 3 группы: 1-я группа — контроль; 2-я — группа доксициклина; 3-я — группа дексаметазона. Взятие проб крови у животных проводили на нулевые, 41-е и 55-е сут. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли гравиметрически, после чего окрашивали их на маркеры и внутриклеточные цитокины. Дифференцировали моноциты (CD3-CD4+) и Т-хелперы (CD3+CD4+). Анализировали динамику внутриклеточной экспрессии интерлейкина IL-4 (рассматривали как маркер про-М2 фенотипа, так как в случае выделения из клетки ИЛ-4 служит стимулятором М2 поляризации макрофагов) и IFN-y (как маркер про-М1 фенотипа) по данным проточной цитофлуориметрии. Применяли непараметрический статистический тест Mann-Whitney-Wilcoxon в программе R для статистической обработки данных. Результаты и заключение. При моделировании сЮИА выявлено закономерное изменение фенотипа моноцитов. Применение же доксициклина и дексаметазона приводило к более ранней поляризации их по про-М2-пути в отношении моноцитов (на 41-е сут.) в сравнении с контролем. Про-М1 эффект (на 55-е сут., в сравнении с контролем) выявлен также в группах доксициклина и дексаметазона. У животных разных групп обнаружены характерные динамические изменения внутриклеточной экспрессии цитокинов. Важно, что различная направленность поляризации фенотипа при сЮИА и применении препаратов наблюдается не только у моноцитов, но и у Т-хелперов. Ключевые слова: системный ювенильный идиопатический артрит; фенотип; моноциты; Т-хелперы; макрофаги. Введение. Цель исследования — изучение возможностей направленной модификации процесса перепрограммирования мононуклеарных клеток на авторской биологической модели системной формы ювенильного идиопатического артрита (сЮИА) у крыс Wistar. Известно, что сЮИА является тяжелой формой патологии, осложняющейся у части пациентов жизнеугрожающим состоянием — синдромом активации макрофагов. Изучение патогенеза этой формы патологии необходимо для разработки эффективной патогенетически обоснованной терапии сЮИА. Именно для сЮИА, среди других форм ЮИА, показано максимальное вовлечение в его патогенез механизмов системы врожденного иммунитета, доказана ключевая роль аутовоспалительного компонента. В то же время, полностью исключить аутоиммунную составляющую патогенеза сЮИА нельзя, так как имеются данные и в ее пользу. Учитывая эти факты, а также то, что существовавшие ранее модели артрита имеют существенные ограничения в связи с описанными выше особенностями патогенеза сЮИА, была разработана авторская модель. Принималось во внимание то, что у молодых крыс ниже воспроизводимость артрита. В связи с этим при разработке указанной модели ранее были использованы 8-месячные крысы, а при воспроизведении модели в данном исследовании — 6-месячные. На основании данных об усредненном соотношении продолжительности жизни человека и лабораторных крыс, 8- и 6-месячный возраст последних соответствует примерно 14 и 11 годам человека. Авторская модель сЮИА имеет ряд преимуществ в сравнении с другими моделями артрита. Она адекватна для изучения процессов перепрограммирования моноцитов/макрофагов в патогенезе артрита, патогенетически наиболее близка к сЮИА (сочетает в себе аутоиммунный компонент и действие стимулятора Ml ответа), имеет более выраженные (по сравнению с «классическим» адъювантным артритом) проявления, не приводит к существенной дезорганизации межклеточного матрикса. Последнее чревато искажением результатов из-за потенцирования коллагенообразования и М2 ответа, что возможно при ряде других моделей и рассматривается нами как их недостаток при решении поставленных нами задач. В настоящей работе на модели сЮИА у крыс Wistar оценивалась внутриклеточная продукция моноцитами и Т-лимфоцитами-хелперами цитокинов, вызывающих перепрограммирование макрофагов: интерлейкина-4 (IL-4) и гамма-интерферона (IFN-y). Оценивалось влияние на экспрессию этих веществ доксициклина и дексаметазона. При этом клетки, вырабатывавшие IFN-y, рассматривались как про-Ml, а клетки, продуцировавшие IL-4 — как про-М2 в связи со способностью указанных цитокинов после выделения их из клеток активировать макрофаги (т.е. указанные клетки обладают потенциальной способностью вызывать Ml и М2 эффекты). В качестве фармакологических препаратов, модифицирующих течение модельного сЮИА, были выбраны доксициклин и дексаметазон. Доксициклин привлекает внимание потому, что на моделях различных форм патологии описана его способность ингибировать М2 активацию макрофагов. Перспективен этот препарат еще и потому, что он способен изменять конформационную стабильность белковых молекул (из-за чего он рассматривался даже как потенциальное средство для борьбы с прионными заболеваниями, демонстрируя убедительные результаты in vitro). Возможно, широкий спектр эффектов доксициклина и обусловлен его способностью снижать активность одних белков (в том числе регуляторных) и повышать ее у других. Глюкокортикоды же определенно относят к группе стимуляторов М2 активации макрофагов, в связи с чем они введены в стандарты лечения ревматических заболеваний. Полученные результаты позволяют оценить изменение фенотипа популяций клеток (моноцитов и Т-хелперов) в целом на протяжении моделирования, в том числе под действием модифицирующих веществ, т.е. позволяют говорить о структуре популяции клеток (по выбранным маркерам) и ее изменении в условиях воспалительного процесса и действии использованных фармакологических препаратов. Полученные данные, в том числе о наличии несколько противоречивых эффектов у оцениваемых препаратов, позволили заключить, что важно оценивать профиль эффектов лекарственного препарата и сравнивать его с профилем интересующего заболевания, а также что общий «противовоспалительный эффект» препарата может включать и провоспалительные его компоненты. Это может объяснить формирование нежелательных эффектов лекарственных средств (при неполном перекрытии вышеуказанных профилей) и открывает еще одно перспективное направление для создания управляемых и «заточенных» под конкретные провоспалительные профили заболеваний стратегий лечения. Методика. Модифицированная модель системного ювенильного идиопатического артрита воспроизведена на 24 крысах Wistar (самцы, 6 мес.). Схема дизайна исследования приведена на рис. 1. Использовано двукратное введение животным полного адъюванта Фрейнда (внутрикожные многоточечные инъекции общим объемом 0,5 мл адъюванта, 1 мг/мл, (Sigma Aldrich, USA) на нулевые и 40-е сут.) и трехкратное липополисахарида (Медгамал, Россия) в возрастающих количествах: нулевые сутки — из расчета 5 мкг/кг массы тела животных, 18-е сут. — из расчета 10 мкг/кг, 40 сут. — по 10 мкг каждому животному. На 40-е сут. все крысы были разделены на 3 группы: в группе «доксициклин» дополнительно подкожно введен раствор доксициклина (Саратов, Россия) из рачета 50 мг/кг массы тела; в группе «дексаметазон» подкожно инъецирован раствор дексаметазона (KRKA, Словения) из расчета 4 мг/кг. В группе «контроль» подкожно введено по 0,2 мл физиологического раствора хлорида натрия (Борисовский завод медицинских препаратов, Борисов, Беларусь). Аналогичные количества доксициклина, дексаметазона и физраствора вводили повторно на 54-е сут. исследования. Взятие образцов крови (для оценки внутриклеточных цитокинов) осуществляли на нулевые, 41-е и 55-е сут. В подготовленных с помощью RPMI-1640 пробах крови форменные элементы подвергались гравиметрическому разделению: 400g на градиенте Histopaque 1083 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Мононуклеарные клетки окрашивались с помощью антител Biotin Anti-Rat CD3, BD Pharmingen; APC Anti-rat CD4 (domain 2) Antibody, SONY; PE Anti-rat IL-4 Antibody, SONY; PE Anti-rat IFN-Y Antibody, SONY. Этап пермебиализации (для внутриклеточных маркеров) проводился с использованием Cytofix/Cyto-perm (BD Cytofix/Cyloperm). Пробы анализировались на проточном цитофлуориметре (Cell Analyzer BD FACSCanto II (USA). Процедуры выполнялись в соответствии с инструкциями производителей. CD3-CD4+ клетки рассматривались с учетом информации BD Biosciences (www.bdbiosciences.com) как моноциты, a CD3+CD4+ клетки как Т-лимфоциты-хелперы. Оценка статистической значимости различий показателей проводилась с использованием программного обеспечения R путем проведения теста Mann-Whitney-Wilcoxon. Статистически значимыми считались различия при р<0,05. На графиках представлены диаграммы размаха для изученных показателей. На указанном типе диаграмм черная горизонтальная линия — медиана. Ящики ограничены 25-м и 75-м перцентилями (Q1 и Q3 соответственно), верхняя граница соответствует Q3+1,5*(Q3-Q1), нижняя: Q1-1,5*(Q3-Q1). Отдельными точками отмечаются выбросы. Ряд статистических приложений, в том числе и R при формировании ящиков определяет не непосредственно квартили 1 и 3, а медианы верхней и нижней половин данных, которые могут несколько отличаться от квартилей, в частности, в зависимости от того, четные или нечетные показатели. Результаты и обсуждение. Доля клеток, экспрессирующих IL-4, среди популяции моноцитов (CD3-CD4+) при моделировании сЮИА у крыс Wistar. Доли иммунологически выявленных моноцитов (CD3-CD4+) с внутриклеточной продукцией IL-4 (рис. 2) статистически значимо изменялись на протяжении исследования, причем обнаружены существенные особенности в различных группах животных. Так, у крыс группы контроля (естественное течение экспериментального сЮИА) обнаружена отсроченность изменений по сравнению с другими группами животных: на 41-е сут. показатель доли клеток, экспрессирующих IL-4, среди популяции моноцитов статистически значимо не отличался от исходных данных. При применении дексаметазона наибольшие медианные значения показателя определялись уже на 41-е сут., на 55-е сут. значения не отличались от таковых на 41-е сут. При этом на 41-е сут. группа «дексаметазон» демонстрировала статистически значимо более высокие доли продуцирующих IL-4 моноцитов по сравнению с контролем. Группа животных «доксициклин» также значимо отличается по указанному показателю от исходных значений уже на 41-е сут. (имея меньшие медианные значения), но не отличается существенно от показателей групп «дексаметазон» и «контроль». Вместе с тем следует отметить, что для долей моноцитов, продуцирующих IL-4, в группе «доксициклин» на 41-е сут. в сравнении с контролем разница была статистически не значима (р = 0,054). У животных групп «контроль» и «доксициклин» отмечено статистически значимое увеличение этого показателя в период между 41-ми и 55-ми сут., а с 55-х сут. все показатели трех групп крыс уже статистически значимо не различались. Таким образом, можно сделать вывод, что как реализация патогенетических звеньев модели сЮИА, так и применение в условиях ее развития вышеуказанных препаратов приводят к перепрограммированию моноцитов в динамике. При этом и доксициклин, и дексаметазон вызывали более раннее (на 41-е сут.) статистически значимое повышение доли моноцитов, экспрессирующих IL-4. Следовательно, оба указанных препарата обладают про-М2 действием, так как после выделения указанного цитокина из клеток он может действовать как аутокринно, так и через влияние на другие мононуклеарные фагоциты. При естественном же течении экспериментального сЮИА в контрольной группе (напомним, что в этой группе на 40-е сут. использовался липополисахарид, полный адъювант Фрейнда и физиологический раствор хлорида натрия) изменения оказываются отсроченными. Доля клеток, экспрессирующих IL-4, среди популяции Т-лимфоицтов-хелперов (CD3+CD4+) при моделировании сЮИА у крыс Wistar Обнаружены особенности динамики изменения показателя долей клеток, продуцирующих IL-4 и среди Т-хелперов (рис. 3). Так, статистически значимое увеличение (по сравнению с исходными данными) указанного показателя наблюдалось только на 55-е сут. При этом у животных группы «дексаметазон» отмечены наибольшие медианные значения и статистически значимое различие с показателями группы «доксициклин». От контроля показатели группы «дексаметазон» не отличалась. Таким образом, можно заключить, что моделирование сЮИА у крыс сопровождалось повышением в динамике доли Т-хелперов, продуцирующих IL-4. Также обращает на себя внимание тот факт, что применение дексаметазона приводит к большему (статистически значимому по сравнению с доксициклином) увеличению этого показателя, т.е. имеет место значимое перепрограммирование популяции Т-хелперов. Доля клеток, экспрессирующих IFN-y, среди популяции монолитов (CD3-CD4+) при моделировании сЮИА у крыс Wistar В популяции моноцитов (рис. 4) на 41-е сут. моделирования сЮИА в условиях применения как доксициклина, так и дексаметазона происходило статистически значимое увеличение процентного содержания моноцитов, вырабатывающих IFN-y, по сравнению с исходными показателями. У контрольных животных отмечено, что показатель долей вырабатывающих IFN-y моноцитов на 41-е сут. был значимо ниже таковых в группах «доксициклин» и «дексаметазон», но не отличался от исходных значений. На 55-е сут. наблюдалось статистически значимое снижение показателя долей моноцитов, вырабатывающих IFN-y, по сравнению с 41-ми сут. во всех группах крыс. При этом у животных групп «доксициклин» и «дексаметазон» показатели не отличались от исходного уровня. В контрольной же группе доли моноцитов, экспрессирующих IFN-y, были статистически значимо ниже исходных. Таким образом, при естественной реализации патогенетических звеньев модели сЮИА у крыс происходит статистически значимое уменьшение доли про-М1 моноцитов (ниже исходного уровня!) и возрастание доли про-М2. В то же время увеличение показателя про-М2 ответа в контрольной группе не было столь выраженным, как в других группах. У животных групп «доксициклин» и «дексаметазон» доли моноцитов, вырабатывающих IFN-y, на 55-е сут. статистически значимо не отличались от исходных, а в контрольной группе в это же время отмечено их статистически значимое снижение по сравнению с исходными данными. Нарастание про-М2 ответа моноцитов в динамике моделирования сЮИА наблюдалось раньше в группах «доксициклин» и «дексаметазон». Таким образом, выявлена существенная роль дексаметазона и доксициклина в перепрограммировании не только макрофагов (что было известно), но и моноцитов. Доля клеток, экспрессирующих IFN-y, среди Т-лимфоцитов-хелперов (CD3+CD4+) при моделировании сЮИА у крыс Wistar В динамике изменений долей Т-хелперов, продуцирующих IFN-y (рис. 5), выявлены следующие изменения: на 41-е сут. только у животных в группе «дексаметазон» обнаружено статистически значимое увеличение таких долей по сравнению с исходными значениями. При этом на 55-е сут. отмечены значимо большие доли продуцирующих IFN-y Т-хелперов в группе «дексаметазон» по сравнению с группой «доксициклин». Таким образом, выявлен факт перепрограммирования популяции Т-хелперов в динамике моделирования сЮИА у крыс Wistar. В группе «дексаметазон» по сравнению с группой «доксициклин» на 55-е сут. наблюдался наибольший процент лимфоцитов, вырабатывающих как IL-4, так и IFN-у. Роль указанной группы клеток при сЮИА требует специального исследования. С одной стороны, продемонстрированный факт может отражать различную активацию Т-хелперов 1 и 2 типа при применении указанных препаратов. Тем не менее, внутри группы CD3+CD4+ описана (и в последнее время интенсивно изучается при самых различных формах патологии) группа Т-регуляторных CD25+ клеток. Однако эта ли субпопуляция привела к обнаруженному в нашем исследовании явлению перепрограммирования Т-хелперов, сказать пока невозможно (что и не было целью данного исследования). В целом по данным оценки про-М1 и про-М2 ответа моноцитов и Т-хелперов можно сделать заключение (таблица), что при применении дексаметазона, в отличие от доксициклина, реализуется большее число компонентов как про-М1, так и про-М2 ответа (т.е. про-М1 и про-М2 ответы моноцитов, а также про-М1 и про-М2 ответы лимфоцитов). Следовательно, можно предположить, что результирующее влияние этих компонентов на проявления сЮИА у крыс зависит от выраженности каждого компонента и их конкретного вклада. Выводы: 1.Реализация патогенетических звеньев модели сЮИА у крыс Wistar приводит к статистически значимому перепрограммированию популяции моноцитов. 2.Раздельное применение доксициклина и дексаметазона при моделировании сЮИА обсуловливает: а) перепрограммирование не только макрофагов (что было известно), но и моноцитов крови (по данным о количестве клеток, продуцирующих IFN-y и IL-4); b)более раннее (в сравнении с контрольной группой) значимое повышение доли моноцитов, экспрессирующих IL-4, что свидетельствует о наличии у обоих препаратов про-М2 эффекта. c)ограничение степени снижения показателя про-М1-ответа моноцитов (про-М1 эффект препаратов). Таким образом, как доксициклин, так и дексаметазон при моделировании сЮИА у крыс Wistar оказывают двоякое воздействие на моноциты: вызывают и про-М1, и про-М2 эффект. 3.Развитие самой модели сЮИА характеризуется определенной динамикой перепрограммирования моноцитов: статистически значимым уменьшением доли про-М1 моноцитов и возрастанием доли про-М2. 4.На 55-е сут. моделирования сЮИА у крыс Wistar выявляется снижение про-М1-ответа моноцитов не только до исходного уровня, но и значимо ниже такового. При этом увеличение показателя про-М2 ответа не было максимально выраженным. 5.Применение при моделировании сЮИА дексаметазона (в сравнении с доксициклином) обусловливает включение большего числа компонентов ответа как про-М1, так и про-М2 направленности. 6.Реализация модели сЮИА у крыс сопровождается перепрограммированием популяции Т-хелперов (увеличением показателя про-М2 ответа на 55-е сут.). 7. Использование дексаметазона, в отличие от доксициклина, при моделировании сЮИА у крыс приводит к более выраженному перепрограммированию Т-хелперов (что проявляется увеличением доли клеток, продуцирующих факторы активации как М1-, так и М2-ответа (IFN-y и IL-4 соответственно).

Авторы:

Издание: Патологическая физиология и экспериментальная терапия
Год издания: 2018
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.61-69. Библ. 14 назв.
Просмотров: 32