МЕТОД ИММУНОБЛОТТИНГА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИЗМЕРЕНИЯ УРОВНЯ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА II В НЕБОЛЬШИХ КОЛИЧЕСТВАХ НЕМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК

Аннотация:

Миозин II типа — основной молекулярный мотор для осуществления актомиозин-зависимых двигательных процессов в клетках. Фосфорилирование регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина по остатку Ser-19 является необходимым условием для активации гладкомышечного/немышечного миозина II и служит биохимическим эквивалентом их активности. Дополнительное фосфорилирование РЛЦ по Thr-18 повышает АТР-азную активность миозина II. Для измерения уровня фосфорилирования РЛЦ миозина по Ser-19 или дифосфорилирования по Thr-18/Ser-19 существует ряд методов, эффективных и надежных при измерениях в богатых миозином тканях. Однако для немышечных клеток, которые характеризуются низким содержанием миозина II и обычно доступны для исследований в существенно меньших количествах, применение этих методов ограничено. В этой связи анализ динамики изменения фосфорилирования РЛЦ в многочисленных образцах немышечных клеток становится серьезной задачей, требующей большого количества клеток. Использование фосфоспецифичных антител повышает чувствительность измерений, но позволяет определить только относительные уровни фосфорилирования РЛЦ по индивидуальным остаткам. Следовательно, сложно говорить о физиологической значимости наблюдаемых изменений. С целью количественного измерения уровня фосфорилирования РЛЦ в небольших количествах немышечных клеток мы использовали калибровочные стандартные нефосфорилированные и фосфорилированные in vitro РЛЦ в иммуноблоттинге с фосфоспецифическими антителами против РЛЦ после классического электрофореза. В настоящей работе приведено подробное описание данного метода и продемонстрировано его применение для количественного измерения изменений уровня фосфорилирования РЛЦ в эндотелиальных клетках человека в ответ на природные агонисты, тромбин и инсулин, а также содержания фосфорилированных РЛЦ в тромбоцитах человека. Обсуждены преимущества и ограничения описываемого метода в сравнении с другими методами измерения уровня фосфорилирования РЛЦ в немышечных клетках.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2019
Объем: 11с.
Дополнительная информация: 2019.-N 1.-С.74-84. Библ. 37 назв.
Просмотров: 29