Мультиплексная полимеразная цепная реакция для количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии ЕН92-527-1 в пищевой продукции

Аннотация:

Цель исследования - разработка протокола количественного определения генно-инженерно-модифицированного (ГМ) картофеля линии ЕН92-527-1 в формате дуплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) по технологии TaqMan® PCR. Материал и методы. Дуплексная система включала 2 вида специфических ДНК-праймеров и флуоресцентно-меченных зондов: первый - для выявления специфичной трансформационному событию ЕН92-527-1 последовательности ДНК, второй - для выявления таксон-специфичного гена картофеля Stp23. Параметры ПЦР выбирали путем эмпирического подбора концентраций праймеров и зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, стабилизирующего агента для полимеразы, температуры отжига праймеров и продолжительности инкубации для каждой стадии цикла. Результатом этих исследований являлся оптимизированный состав реакционной смеси для идентификации ЕН92-527-1 и фрагмента гена Stp23 в дуплексной системе: 2,5-кратный реакционный буфер для проведения ПЦР-РВ в присутствии флуоресцентного красителя ROX (carboxy-X-rhodamine), праймеры, специфичные для ГМ-компонента (EH92-f/EH92-r) и целевого таксона (GPF3/GPR3) в количестве 250/250 и 100/100 нМ, зонды - 200 и 200 нМ соответственно; бычий сывороточный альбумин - 0,04%; MgCl2 - 3,5 мМ, дезоксинуклеозидтрифосфаты - 0,3 мМ, а также температурно-временной профиль реакции (начальная денатурация 95°С - 5 мин, последующие 45 циклов: 95°С - 20 с, 58°С - 20 с, 62°С - 40 с). Заключение. Разработан метод количественного определения ДНК ГМ-картофеля линии ЕН92-527-1 в формате дуплексного ПЦР-анализа. Линейность, прецизионность, правильность и предел определения метода подтверждены в исследованиях in vitro и свидетельствуют о его надежности.

Авторы:

Издание: Вопросы питания
Год издания: 2019
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2019.-N 1.-С.57-61. Библ. 12 назв.
Просмотров: 27