ПОЛУЧЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ ФИБРОБЛАСТОВ ПАЦИЕНТА С МУКОВИСЦИДОЗОМ

Аннотация:

Цель исследования: Разработка протокола получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и создание линии ИПСК, полученной из клеток от пациента с муковисцидозом, вызванным гомозиготной мутацией F508del. Материал и методы. ИПСК получали путем репрограммирования культивированных фибробластов кожи пациента с муковисцидозом с помощью вируса Сендай. Наличие мутации в гене CFTR в фибробластах и полученных ИПСК подтверждали методом секвенирования ДНК по Сэнгеру. Полученный клон ИПСК культивировали до стадии эмбриоидных телец и после спонтанной дифференцировки окрашивали иммуноцитохимически. Анализ экспрессии генов в полученной линии ИПСК проводили с помощью иммуноцитохимического окрашивания и полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для подтверждения отсутствия хромосомных перестроек проводили анализ кариотипа полученных ИПСК. Результаты. Полученная линия ИПСК демонстрировала морфологию эмбриональных стволовых клеток. Клетки имели нормальный кариотип 46,XY, специфично окрашивались антителами на маркеры плюрипотентности (Oct4, Nanog, TRA-1-81 и SSEA-4) в иммуноцитохимическом анализе, а также демонстрировали экспрессию маркеров плюрипотентности (ОСТ4, NANOG и FOXD3) в ОТ-ПЦР. В культуре дифференцированных ИПСК выявлены клетки, положительно окрашенные антителами на маркеры трех зародышевых листков - эктодермы (b-Ш-тубулин), мезодермы (фибронектин) и энтодермы (а-фетопротеин). Заключение. Таким образом, нами отработан протокол получения и характеризации ИПСК и создана линия ИПСК, а также подтверждена их функциональная и фенотипическая плюрипотентность.

Авторы:

Издание: Сибирское медицинское обозрение
Год издания: 2019
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2019.-N 2.-С.95-101. Библ. 15 назв.
Просмотров: 24