Полный текст
Т.С. Коменкова1, Е.А. Зайцева1, Н.В. Стрельникова2,3
Фенотипическая и генетическая характеристика желатиназной активности у клинически значимых enterococcus faecalis, выделенных на Дальнем Востоке России
1Тихоокеанский государственный медицинский университет, 690002, пр-т Острякова, 2, тел. 8-(423)-245-17-06, e-mail: vgmu.nauka@ mail.ru, г. Владивосток;
2Дальневосточный государственный медицинский университет, 680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел. 8-(4212)-76-13-96,e-mail: nauka@mail.fesmu.ru, г. Хабаровск;
3Краевая клиническая больница № 1 им. проф. С.И. Сергеева, 680009, ул. Краснодарская, 9, тел. 8-(4212)-39-04-05, e-mail:kkb1@dvmc.khv.ru, г. Хабаровск
Контактная информация: Т.С. Коменкова, е-mail: atstl@mail.ru
Резюме:
В последнее десятилетие возросла этиологическая роль бактерий рода Enterococcus. Известно, что тяжесть системных заболеваний обуславливает наличие гена gelE, кодирующий синтез желатиназы. Установлено, что штаммы E. faecalis, продуцирующие данный фермент, более вирулентны. В работе проанализированы фенотипические особенности и генетическое разнообразие желатиназной активности у клинических изолятов Enterococcus faecalis, выделенных в Дальневосточном регионе России. Отмечена фенотипическая и генетическая вариабельность желатиназной активности среди клинически значимых E. faecalis. Ген gelE, детектировался у 74,5±6,1 % E. faecalis, выделенных в Приморском и Хабаровском краях. Однако in vitro разжижение желатины наблюдалось только у 30,2±7,1 % изучаемых энтерококков. Выявлено большое количество E. faecalis с "молчащим" геном gelE, что требует дальнейшего изучения.
Ключевые слова:
Enterococcus faecalis, gelE, желатиназная активность
T.S. Komenkova1, E.A. Zaitseva1, N.V. Strelnikova 2,3
Phenotypic and genetic characteristics of gelatinase activity in clinically relevant enterococcus faecalis in the Far East of Russia
1Pacific state medical university, Vladivostok;
2Far eastern state medical university;
3Regional clinical hospital № 1 of Khabarovsk Region Health Ministry, Khabarovsk
Summary:
The etiological role of the genus Enterococcus has increased in the last decade. It is known that the severity of systemic diseases is associated with gelatinase activity encoded by gelE gene. It has been revealed that gelatinase-producing E. faecalis are more virulent. In the present study the phenotypic features and genetic diversity of gelatinase activity of E. faecalis clinical isolates in the Far East of Russia were analyzed. It has been described that clinically relevant E. faecalis have phenotypic and genetic variability of gelatinase activity. Presence of gelE gene was detected in 74,5±6,1 % of E. faecalis. However, in vitro liquefaction of gelatin was observed only in 30,2±7,1 % of studied enterococci. A large number of E. faecalis with a "silent" gelE gene has been identified. It requires further study.
Key words:
Enterococcus faecalis, gelE, gelatinase activity
Введение
В последнее десятилетие возросла этиологическая роль бактерий рода Enterococcus [10, 13]. Колонизируясь на слизистых оболочках полости рта, кишечника, коже, периуретральной области, обладая особой тропностью к почечной ткани, они могут вызывать эндокардит, инфекции кожи и мягких тканей, мочеполовой системы, остеомиелит, катетер-ассоциированные инфекции и др. [5, 6, 11, 12, 13].
В настоящее время идентифицированы разнообразные факторы вирулентности энтерококков, наиболее важными из которых являются гемолизин (Cyl), желатиназа (GelE), энтерококковый поверхностный белок (Esp), субстанция агрегации (As), адгезин коллагена (Ace), сериновая протеаза (SprE) и т.д. [1, 5, 7, 8, 13].
Желатиназа (цинк-зависимая металлопротеиназа), опосредуемая геном gelE, ответственна за гидролиз гемоглобина, желатина, коллагена и других белков [1]. Известно, что экспрессия гена gelE обуславливает тяжесть системных заболеваний, способствует образованию биопленок и очищает поверхность клеток от мутантных белков [1, 5, 11, 13]. Установлено, что штаммы E. faecalis, продуцирующие данный фермент, более вирулентны [5]. В тоже время роль гена gelE E.faecalis до конца не выяснена.
Цель исследования - оценить фенотипическое и генетическое разнообразие желатиназной активности у клинически значимых E. faecalis, выделенных в Дальневосточном регионе России.
Материалы и методы
В работе исследованы Е. faecalis (n=51), изолированные из клинического материала - мочи (n=40), цервикального канала (n=2), уретры (n=1), секрета простаты (n=2), мокроты (n=2), бронхоальвеолярного лаважа (n=1), хирургической раны (n=3) - пациентов в Приморском и Хабаровском краях. В качестве референс-штамма использовали E. faecalis NCTC 12697.
Биологические свойства энтерококков изучали классическим бактериологическим методом. Желатиназную активность определяли с использованием коммерческого набора Микро-ЖЕЛАТИНАЗА-НИЦФ (Санкт-Петербург, Россия), ферментацию молока - на среде Эйкмана.
Бактериальную ДНК энтерококков выделяли кипячением (Т. Маниатис, 1984). Детекцию гена gelE у E. faecalis проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), применяя систему праймеров - 5'ACCCCGTATCATTGGTTT3' и 5'ACGCATTGCTTTTCCATC3' (размер продукта 419 п.н.) (Soares R.O., et al., 2014), синтезированную компанией "Евроген" (Россия). Реакционная смесь (20 мкл) включала 10х Taq buffer (2 мкл), 25 mM MgCl2 (1,6 мкл), дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (0,8 мкл), специфические праймеры (по 0,4 мкл), Tag DNA - полимеразу (0,8 мкл) (Евроген, Россия), бактериальный лизат (1 мкл).
ПЦР проводили на амплификаторе TProfessional 96 (Biometra, Германия) по протоколу: 1 цикл - 94 °С, 5 мин.; далее 30 циклов в режимах 94 °С - 45 с; 56°С - 1 мин.; 72 °С - 1 мин.; финальное удлинение 72 °С - 3 мин.
Продукты амплификации анализировали в 1 % агарозном геле, содержащим 1 мкг/мл бромистого этидия, в ультрафиолетовом свете с помощью Bio Doc Analyze (Biometra, Германия).
Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 10. Средние значения в группах сравнивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и t-критерия Стьюдента. Корелляционый анализ проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена.
Результаты и обсуждение
В исследованиях проведенными нами ранее были изучены фенотипические проявления биологических свойств фекальных энтерококков, выделенных из клинического материала, оценены особенности протеолитической активности Е. faecalis [3]. Установлено, что более половины исследуемых энтерококков (53,5±7,6 %) показали in vitro протеолитическую активность. При этом ферментировали и молоко и желатину 30,2±7,1 % исследуемых культур, только молоко - 23,3±6,4 % Е. faecalis. Энтерококков, обладающих только желатиназной активностью, в исследуемой коллекции не было.
В связи с выявленной фенотипической неоднородностью протеолитической активности Е. faecalis мы обратились к молекулярно-генетическим методам исследования. С помощью ПЦР был проведен анализ энтерококков на наличие гена gelE, кодирующего синтез желатиназы.
Ген gelE, детектировался у 74,5±6,1 % E. faecalis, выделенных в Приморском и Хабаровском краях (таблица). Однако in vitro разжижение желатины наблюдалось только у трети изучаемых культур (рисунок). Такое не соответствие фенотипического проявления желатиназной активности с наличием гена gelE у энтерококков также отмечалось в других независимых исследованиях [2, 4, 7, 8, 9, 11]. Например, в работах Saffari F. (2017) и Strzelecki Y. (2011) ген gelE выявлялся у 72 % и 91 % энтерококков, тогда как желатиназная активность обнаружена только у 34 % и 53 % культур соответственно [7, 11]. В исследовании Semedo T. (2003) при оценке энтерококков, выделенных из клинического материала и пищевых продуктов, ген gelE был "молчащим" у большинства исследованных штаммов, однако желатиназная активность регистрировалась преимущественно у клинических изолятов [8]. Многие ученые связывают такие особенности с отсутствием экспрессии гена и/или мутацией в gelE или в регуляторных генах fsrA, fsrB, fsrD, fsrC, активирующих синтез желатиназы [7, 11].
Рис. 1. Наличие гена gelE и желатиназной активности у Е. faecalis
Примечание. М - маркер молекулярного веса (GeneRuler 1kb DNA Ladder, Thermo Scientific, США); 1-21 - клинические штаммы Е. faecalis, 5 - Е. faecium, к - отрицательный контроль.
Таблица. Наличие протеолитической активности и гена gelE у культур энтерококков, выделенных в Приморском и Хабаровском краях
Место выделения культуры
Кол-во исследованных культур
Ферментация
Кол-во исследованных культур
Наличие гена gelE
абс. (Р±mр, %)
желатины
молока
абс. (Р±mр, %)
абс. (Р±mр, %)
Приморский край
36
9 (25,0±7,2)
19 (52,8±8,3)
44
32 (72,7±6,7)
Хабаровский край
7
4
4
7
6
Всего
43
13 (30,2±7,1)
23 (53,5±7,6)
51
38 (74,5±6,1)
Методом корреляционного анализа была выявлена достоверная положительная связь между наличием гена gelE и желатиназной активностью у исследованных энтерококков, выделенных в Дальневосточном регионе России (rp=0,40; p=0,01). В тоже время в литературе есть сведения об отсутствии прямой зависимости между этими признаками [1]. Тем не менее, установленная в данной работе связь показывает необходимость определять желатиназную активность in vitro для оценки клинической значимости штаммов энтерококков, и согласуется с исследованиями Мироненко Л.Г. и соавт. (2013) [4]. Полученные нами результаты открывают перспективу дальнейших исследований в этом направлении.
Выводы
1. Более половины (52,8±8,3 %) E. faecalis, выделенных из клинического материала на Дальнем Востоке России, обладают протеолитической активностью, при этом in vitro разжижение желатины встречалось у 30,2±7,1 % исследованных энтерококков.
2. Отмечена фенотипическая и генетическая вариабельность желатиназной активности среди клинически значимых E. faecalis, выделенных в Дальневосточном регионе России.
3. Выявлено большое количество (30,2±7,1 %) E. faecalis с "молчащим" геном gelE.
Литература
1. Бухарин О.В., Валышев А.В. Биология и экология энтерококков: монография // Екатеринбург: УрО РАН, 2012. - 227 с.
2. Валышева И.В., Потехина Л.П., Пошвина Д.В., Щепитова Н.Е., Сычева М.В. Характеристика желатиназной активности энтерококков на фенотипическом и генетическом уровне // Материалы 2-й научно-практической школы-семинара. Тольяттинский государственный университет. - Тольятти: Издательство: SIMJET (Ульяновск), 2012. - С. 197-202.
3. Зайцева Е.А., Крукович Е.В., Мельникова Е.А., Лучанинова В.Н., Коменкова Т.С., Вайсеро Н.С. Роль факторов патогенности Enterococcus faecalis в развитии пиелонефрита у детей // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2017. - № 2. - С. 58-61.
4. Мироненко Л.Г., Перетятько Е.Г. Изучение желатиназной активности на генетическом и фенотипическом уровне у Enterococcus, выделенных из разных экотопов // Вiсник проблем бiологii i медицини. - 2013. - Т. 1, № 4. - С. 239-242.
5. Gilmore M. S, Clewell D.B, Yasuyoshi I., Shankar N. Enterococci from commensals to leading causes of drug resistant infection // Massachusetts eye and ear infirmary Boston. - 2014. - 668 р.
6. Kafil H.S., Mobarez A.M. Assessment of biofilm formation by enterococci isolates from urinary tract infections with different virulence profiles // Journal of King Saud University - Science. - 2015. - 6 р.
7. Saffari F., Dalfardi M.S., Mansouri S., Ahmadrajabi R. Survey for Correlation between Biofilm Formation and Virulence Determinants in a Collection of Pathogenic and Fecal Enterococcus faecalis Isolates // Infect Chemother. - 2017. - Vol. 49, № 3. - Р. 176-183.
8. Semedo T., Santos M.A., Lopes M.F., Figueiredo M.J., Barreto C.M.T., Tenreiro R. Virulence factors in food, clinical and reference Enterococci: A common trait in the genus? // Syst Appl Microbiol. - 2003. - Vol. 26, № 1. - Р. 13-22.
9. Simonova P.M., Laukova A. Virulence factors genes possessing Enterococcus faecalis strains from rabbits and their sensitivity to enterocins // Worid Rabbit Science. - 2017. - № 25. - P. 63-71.
10. Soares R.O., Fedi A.C., Reiter K.C., Caierão J., d'Azevedo P.A. Correlation between biofilm formation and gelE, esp, and agg genes in Enterococcus spp. clinical isolates // Virulence. - 2014. - Vol. 5, № 5. - Р. 634-637.
11. Strzelecki Y., Hryniewicz W., Sadowy E. Gelatinase-Associated Phenotypes and Genotypes Among Clinical Isolates of Enterococcus faecalis in Poland // Polish Journal of Microbiology. - 2011. - Vol. 60, № 4. - P. 287-292.
12. Toru M., Beyene G., Kassa T., Gizachew Z., Howe R., Yeshitila B. Prevalence and phenotypic characterization of Enterococcus species isolated from clinical samples of pediatric patients in Jimma University pecialized Hospital, south west Ethiopia // BMC Res Notes. - 2018. - Vol. 11, № 281. - 6 р.
13. Upadhyaya G.P.M., Ravikumar K.L., Umapathy B.L. Review of virulence factors of enterococcus: An emerging nosocomial pathogen // Indian J Med Microbiol. - 2009. - Vol. 27. - P. 301-305.
В последнее десятилетие возросла этиологическая роль бактерий рода Enterococcus . Колонизируясь на слизистых оболочках полости рта, кишечника, коже, периуретральной области, обладая особой тропностью к почечной ткани, они могут вызывать эндокардит, инфекции кожи и мягких тканей, мочеполовой системы, остеомиелит, катетер-ассоциированные инфекции и др. В настоящее время идентифицированы разнообразные факторы вирулентности энтерококков, наиболее важными из которых являются гемолизин (Cyl), желатиназа (GelE), энтерококковый поверхностный белок (Esp), субстанция агрегации (As), адгезин коллагена (Ace), сериновая протеаза (SprE) и т.д.Желатиназа (цинк-зависимая металлопротеиназа), опосредуемая геном gelE, ответственна за гидролиз гемоглобина, желатина, коллагена и других белков. Известно, что экспрессия гена gelE обуславливает тяжесть системных заболеваний, способствует образованию биопленок и очищает поверхность клеток от мутантных белков . Установлено, что штаммы E. faecalis, продуцирующие данный фермент, более вирулентны . В тоже время роль гена gelE E.faecalis до конца не выяснена.Цель исследования - оценить фенотипическое и генетическое разнообразие желатиназной активности у клинически значимых E. faecalis, выделенных в Дальневосточном регионе России.В последнее десятилетие возросла этиологическая роль бактерий рода Enterococcus. Известно, что тяжесть системных заболеваний обуславливает наличие гена gelE, кодирующий синтез желатиназы. Установлено, что штаммы E. faecalis, продуцирующие данный фермент, более вирулентны. В работе проанализированы фенотипические особенности и генетическое разнообразие желатиназной активности у клинических изолятов Enterococcus faecalis, выделенных в Дальневосточном регионе России. Отмечена фенотипическая и генетическая вариабельность желатиназной активности среди клинически значимых E. faecalis. Ген gelE, детектировался у 74,5±6,1 % E. faecalis, выделенных в Приморском и Хабаровском краях. Однако in vitro разжижение желатины наблюдалось только у 30,2±7,1 % изучаемых энтерококков. Выявлено большое количество E. faecalis с "молчащим" геном gelE, что требует дальнейшего изучения.
Добавить в коллекцию