МЕТАГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА ГНЁЗД ДЛИННОХВОСТОГО СУСЛИКА В ТУВИНСКОМ ПРИРОДНОМ ОЧАГЕ ЧУМЫ

Аннотация:

В Тувинском природном очаге чумы длиннохвостый суслик является основным носителем Yersinia pestis, а его эктопаразиты играют ключевую роль в трансмиссии и сохранении возбудителя [Вержуцкий, 2012]. В 1974-85 гг. в Горно-Алтайском и Тувинском природных очагах чумы изучался видовой состав бактерий у личинок блох и в гнездовых субстратах грызунов и пищух методами классической бактериологии. Идентифицировать удавалось не более четверти от выделенных культур, в частности, из 430 алтайский изолятов установлена таксономическая принадлежность 91 культуры [Васильев, Булгадаева, Базанова, 1981]. С тех пор значительно изменилась систематика бактерий, а методы молекулярной биологии расширили возможности в сфере идентификации и обнаружения микроорганизмов, в том числе и некультивируемых. Изучение таксономического состава сообществ микроорганизмов на основе анализа тотальной ДНК - одно из актуальных направлений, имеющее как фундаментальное, так и прикладное значение. Цель исследования - анализ состава бактериальных сообществ субстрата гнезд длиннохвостого суслика в Тувинском природном очаге чумы. В мае 2019 г. в рамках планового эпизоотологического обследования на участке Оруггуг было добыто три гнезда длиннохвостого суслика. Гнездо № 1 - свежее выводковое, с шестью детенышами-сосунками, сравнительно сухое. В субстрате сухая трава, зеленая трава, шерсть, растительная труха. Гнездо № 2 - зимовочное обитаемое относительно сухое. В субстрате - мелкая сухая трава, перепревшая в более старых слоях выстилки, остатки запасов корма (семена Bistorts vivipara), помет суслика. Гнездо № 3 - индивидуальное обитаемое, очень сухое, пыльное. В субстрате очень мелкая сухая трава, растительные волокна и шерсть. В гнездах обнаружены имаго семи видов блох: Citellophiius tesquorum, Frontopsylla elatoides, F. hetera, Qropsylla alaskensis, Neopsylia mana, Radiriopsylla li transbaikalica, F. frontalis baikal. Численно преобладали специфические паразиты суслика С. tesquorum и F. elatoides. Все семь видов были представлены в гнезде № 2 со значительным количеством имаго 0. alaskensis - 14,2 %. В гнезде № 3 относительно высока доля R. li transbaikalica - 21,6 %. Поражён-ность блох гельминтами в трёх гнёздах составила соответственно 14,5 - 17,9 - 7,8 %, тироглифоид-ными клещами 8,2 -18,9 - 13,7 %. В гнезде № 1 очень мало гамазовых клещей - всего 9 особей, по сравнению с зимовочным (40 экз.) и индивидуальным (105 экз.). Особенностью гнезда № 2 было наличие личинок блох (60 экз.) и личинок двукрылых (38 экз.). Пробы субстрата гнёзд и блохи исследованы на наличие У. pestis молекулярно-генетическими и серологическими методами с отрицательным результатом. Один грамм рандомизированной пробы субстрата каждого гнезда замачивали 30 мин в 100 мл физиологического раствора, после отстаивания взвешенных частиц одинаковый объём каждой пробы (20 мл) концентрировали на поликарбонатных кассетных фильтрах Sterivex Millipore 0,22 мкм и хранили до выделения ДНК при -18 °С. Выделение тотальной ДНК с фильтров осуществляли с помощью набора «ДНК-сорб-В» («Ам-плисенс»). Проводили амплификацию V3-V4 вариабельных участков 16S rRNA бактерий и секвениро-вание пула ампликонов на приборе lllumina MiSeq в соответствии со стандартным протоколом [16S Metagenomic Sequencing Library Preparation], Для отделения и аннотации таксономических единиц использовали способ расчета Open Reference в программе QIIME v.1, для предобработки данных - пакеты trimmomatic и flash. Кластеризацию в OTU (оперативные таксономические единицы) и оценку видового разнообразия проводили на уровне сходства 97 %. Визуализация и анализ таблиц представленности, включая расчет коэффициентов видового богатства и разнообразия (Асе, Chao и Shannon), проведен в системе d3b. Концентрация пробы ДНК, выделенной из гнезда №1 (свежевыводковое), оказалась за пределами чувствительности метода, ампликон с данной пробы не был получен. С проб ДНК из гнезда № 2 и № 3 получено 4053 и 6091 ридов, прошедших фильтрацию и классифицированных в OTU. Исходя из рассчитанных индексов: Shannon - 6,36 и 5,35, Chao - 349,99 и 314,52, Асе - 366,62 и 328,95, для гнезд № 2 и № 3 соответственно, наибольшим видовым богатством и разнообразием характеризуется проба гнезда № 2, в котором, как отмечено выше, полнее всего представлена фауна эктопаразитов и нидиколов гнёзд. Анализ исследуемых микробиомов на уровне фил показал, что в пробе из гнезда № 2 доминирует фила Proteobacteria, составляя 61,8 % сообщества, следующая по представленности фила Actinobacteria - 33,5 %, далее Bacteroidetes 2,5 %, Firmicutes -1,2 %, ТМ7 - 0,5 %, Verrucomicrobia -0,4 %. Проба из гнезда № 3 резко отличается от предыдущего доминированием филы Actinobacteria -84,6 %, следующие по представленности филы: Firmicutes - 12,5 %, Proteobacteria - 1,7 %, Verrucomicrobia - 0,6 %. Преобладание филы Actinobacteria в гнезде № 3 может быть связано с особенной сухостью субстрата гнезда, как указано выше. Фила Actinobacteria часто имеет большую долю в микробиомах сухих почв [Першина, 2017], устойчивость этих микроорганизмов к низкой влажности также подтверждается культуральными методами [Звягинцев, Зенова, 2001]. Анализ таксонов на уровне рода показал, что доминирование актинобактерий в пробе из гнезда № 3 обусловлено встречаемостью Brevibacterium, к нему относится 1413 ридов (33,9 % сообщества), и Brachybacterium - 2065 ридов (22,2 %). В пробе из гнезда № 2 к Brevibacterium и Brachybacterium отнесено всего 41 и 65 ридов, соответственно. Представители рода Brevibacterium способны к разложению инсектицидов из группы синтетических пиретроидов [Bhatt, 2019], широко используемых для дезинсекции в природных очагах чумы, что может быть одной из причин утраты активности данных препаратов во внешней среде и, как следствие, необходимости повторных обработок. В гнезде № 2 преобладание Proteobacteria обусловлено представителями класса Alphaproteobacteria

Авторы:

Издание: Дальневосточный журнал инфекционной патологии
Год издания: 2019
Объем: 3с.
Дополнительная информация: 2019.-N 37.-С.54-56. Библ. 0 назв.
Просмотров: 37