РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ДЛЯ ПАРАЛЛЕЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ РАЗЛИЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ В ФОРМАТЕ ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗА

Аннотация:

Качественно новый уровень диагностики инфекционных болезней может быть достигнут при проведении множественного параллельного анализа, направленного на одновременное выявление нескольких видов специфических маркеров. Дот-иммуноанализ предназначен для распознавания специфической реакции «антиген-антитело», обеспечивает возможность одновременного выявления маркеров десятков инфекций, сохраняя при этом высокую чувствительность скрининговых методов, высокую специфичность подтверждающих тестов и небольшие объемы исследуемого образца. Цель - разработка тест-системы в формате дот-иммуноанализа для параллельного определения специфических антител к антигенам возбудителей чумы, туляремии и бруцеллеза в биологическом материале. Для изготовления тест-системы для дот-иммуноанализа использовали персональный минип-лоттер «Xactll™ Microarray System» («LabNEXT», США), нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 0,2 мкм и 0,45 мкм (Schleicher & Schuell. Германия) и очищенные антигены возбудителей (кап-сульный антиген F1 чумного микроба, липополисахарид (ЛПС) возбудителя туляремии и комплексный бруцеллезный антиген на основе водорастворимых антигенов Brucella melitensis, В. abortus и В. suis). Препараты брали в концентрации 1 мг/мл. Антигены наносили методом контактной печати в виде дискретно расположенных точек диаметром 300 мкм, образующих буквы «Ч» - для выявления чумных антител, «Т» - для туляремийных антител и «Б» - для бруцеллезных. Антигены наносили по 10 нл в буфере для печати (фосфатно-солевой буфер (ФС5), содержащий 5 % глицерина и 0,01 % твин-20). Все три антигена наносили в одну зону печати размером 4x5 мм на нитроцеллюлозную мембрану с просушкой каждого слоя. Иммобилизацию антигенов осуществляли в течение 20 мин при температуре 60 °С с последующей обработкой блокирующим буфером (0,5 % бычий сывороточный альбумин в 0,01 ммоль фосфатно-солевого буферного раствора) в течение 30 мин при температуре 23-35 °С. Слайды высушивали путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 1 мин. Для выявления специфических антител нитроцеллюлозную мембрану инкубировали в течение 20 мин при температуре 37 °С в одной из изучаемых сывороток, разведенной 0,85 % раствором NaCI 1:100. Анализ проводили с использованием коммерческих препаратов: иммуноглобулинов чумных диагностических для РА (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора), сыворотки диагностической туляремийной для РА (ФКУЗ Иркутский НИПЧИ Роспотребнадзора), сыворотки диагностической бруцеллезной моноспецифической anti-abortus (ФКУЗ Ставропольский НИПЧИ Роспотребнадзора). Сайты связывания мембраны блокировали 3 % раствором бычьего сывороточного альбумина в течение 15 мин при температуре 37 °С, отмывали фосфатно-солевым буфером и проявляли универсальным конъюгатом стафилококкового белка А с наночастицами золота. Учет проводили визуально. Для документирования результатов использовали фотокамеру.

Авторы:

Издание: Дальневосточный журнал инфекционной патологии
Год издания: 2019
Объем: 2с.
Дополнительная информация: 2019.-N 37.-С.89-90. Библ. 0 назв.
Просмотров: 22