ОЦЕНКА МЕХАНИЗМОВ ТОКСИННЕЙТРАЛИЗУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ПРОТЕКТИВНОМУ АНТИГЕНУ BACILLUS ANTHRACIS

Аннотация:

Для лечения сибирской язвы, в особенности для нейтрализации эффектов, вызванных воздействием летального токсина Bacillus anthracis, возможно применение иммуноглобулиновых препаратов. Наилучшим вариантом являются антитела, обладающие токсин-нейтрализующей активностью и представляющие собой иммуноглобулины. Также при разработке прототипа любого терапевтического препарата важно определить механизм его действия. Ранее методами классической гибридомной технологии нами была получена панель мышиных моноклональных антител (МКАт), специфичных к компонентам летального токсина (ЛТ) возбудителя сибирской язвы - летального фактора (ЛФ) и протективного антигена (ПА). Каждое МКАт было проанализировано in vitro в МТТ-тесте на клеточной линии J774.1A на предмет нейтрализации действия сибиреязвенного летального токсина, а также in vivo на мышиной модели. По результатам из всей панели было отобрано перспективное для дальнейшего исследования МКАт 1Е10 со специфичностью к ПА, которое успешно нейтрализовало действие сибиреязвенного ЛТ в обоих тестах и может рассматриваться в качестве потенциального терапевтического препарата. Одним из требований, предъявляемым к лечебным препаратам, является выявление механизмов их действия. Цель исследования - выявить механизм нейтрализации летального токсина В. anthracis мо-ноклональным антителом 1Е10. Нейтрализация летального токсина посредством блокирования функции ПА может быть осуществлена через воздействие антитела на ПА на различных этапах токсического воздействия. При поиске механизма токсиннейтрализующей активности МКАт 1Е10 мы рассматривали несколько ключевых процессов: 1) адгезия ПА на поверхности клетки; 2) образование олигомера ПА; 3) проникновение ЛФ и ПА в составе препоры внутрь клетки; 4) образование истинной поры и выход ЛФ в цитозоль. В первую очередь оценивали связывание ПА с рецепторами на поверхности макрофагов линии J774.1A. Для этого клетки инкубировали с флуорохром-меченным ПА-FITC или с ПА-FITC, заранее инкубированным с МКАт в эквимолярном соотношении. После тщательной отмывки клеток их фиксировали и анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Aria III (BD, США). Проведенный эксперимент показал, что МКАт 1Е10 не блокируют адгезию ПА на поверхности клеток. Затем оценивали способность МКАт 1Е10 блокировать образование олигомеров ПА. Для этого полноразмерный ПА (ПА83) обрабатывали трипсином для расщепления белка на ПА20 и ПА63, ингибировали трипсин, после чего индуцировали процесс олигомеризации ПА63 добавлением буфера MES рН 5.5. Тестируемое антитело 1Е10 инкубировали с мономерами ПА63 (в эквимолярном соотношении) до добавления MES-буфера в течение одного часа. Результат оценивали методом имму-ноблоттинга. Для этого полученные после инкубации растворы без денатурации наносили на недена-турирующий полиакриламидный гель 4-20 % и разделяли белки электрофоретически. Белки из геля переносили на PVDF мембрану полусухим методом и определяли ПА при помощи анти-ПА антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Образование четких олигомерных полос ПА с молекулярной массой 440-480 кДа регистрировалось в обоих случаях.

Авторы:

Издание: Дальневосточный журнал инфекционной патологии
Год издания: 2019
Объем: 2с.
Дополнительная информация: 2019.-N 37.-С.96-97. Библ. 0 назв.
Просмотров: 30