Мультиплексная полимеразная цепная реакция для количественного определения генно-инженерно-модифицированного картофеля линии AV43-6-G7. Доказательство эффективности

Аннотация:

Одним из путей совершенствования методологии лабораторного контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами растительного происхождения (ГМО)является использованием ультиплексирования - подхода, который позволяет увеличить число определяемых мишеней и повысить количество одномоментно обрабатываемых образцов, максимально реализуя потенциал полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Цель исследования - разработка протокола количественного определения генно-инженерно-модифицированного (ГМ) картофеля линии AV43-6-G7 в формате дуплексной ПЦР-РВ по технологии TaqMan PCR. Материал и методы. Дуплексная система включала 2 вида специфических ДНК-праймеров и флуоресцентно-меченных зондов: первый - для выявления специфичной трансформационному событию AV43-6-G7 последовательности ДНК, второй - для выявления таксон-специфичного гена картофеля Stp23. Параметры ПЦР выбирали путем эмпирического подбора концентраций праймеров и зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, стабилизирующего агента для полимеразы, температуры отжига праймеров и продолжительности инкубации для каждой стадии цикла. Результаты. В результате исследований был оптимизирован состав реакционной смеси для обнаружения и количественного определения ГМ-картофеля линии AV43-6-G7 в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Подобраны олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентные зонды. Апробированы составы реакционных смесей и температурно-временные параметры ПНР: 2,5-кратный реакционный буфер для проведения ПЦР-РВ в присутствии ROX (carboxy-X-rhodamine), праймеры, специфичные для ГМ-компонента (AV43-6-G7-//AV43-6-G7-T) и целевого таксона (GPF3/GPR3) в количестве 300 нМ/300 нМ и 100 нМ/ 100 нМ, зонды - 200 нМ и 200 нМ соответственно; бычий сывороточный альбумин - 0,04%; MgCl2 - 3,5 мМ, дезоксинуклеозидтрифосфаты - 0,3 мМ, а также температурно-временной профиль реакции (начальная денатурация 95°С - 5 мин, последующие 45 циклов: 95°С - 20 с, 58°С - 20 с, 62°С - 40 с). Заключение. Валидность разработанного метода подтверждена лабораторными исследованиями и свидетельствует о его надежности.

Авторы:

Издание: Вопросы питания
Год издания: 2020
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2020.-N 3.-С.62-70. Библ. 5 назв.
Просмотров: 11