Разработка иммуноферментного метода контроля качества вакцины на основе гибридного рекомбинантного белка PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Аннотация:

Гибридный рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI, содержащий в своем составе аминокислотные последовательности трех наиболее значимых антигенов P. aeruginosa (мембранных белков OprF, OprI и анатоксина аТох), был включен в состав вакцины против синегнойной инфекции. Контроль качества гибридного рекомбинантного белка и вакцины на его основе предполагает определение его подлинности и полноты сорбции препарата на гидроксиде алюминия. Цель исследования — разработка иммуноферментного метода контроля качества вакцинного препарата на основе гибридного рекомбинантного белка P. aeruginosa. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, специфичные к слитому рекомбинантному белку, были получены путем слияния злокачественной линии миеломы мыши и иммунных спленоцитов мышей, вакцинированных отдельными рекомбинантными белками синегнойной палочки. Для наработки антител в препаративных количествах гибридные клетки культивировали in vivo в мышах линии BALB/c. Супернатанты клеточных культур и асцитные жидкости хроматографически очищали на иммунном сорбенте. Конъюгирование антител с пероксидазой хрена проводили согласно методу Nakane Р.К. Гибридный рекомбинантный белок OprF-aTox-OprI выявляли в твердофазном иммуноферментном анализе с использованием полученной панели моноклональных антител и конъюгатов моноклональных антител с пероксидазой корня хрена, специфичных к различным эпитопам белка. В качестве калибровочных стандартов для построения калибровочного графика использовали разведения, содержащие от 78 нг/мл до 5000 нг/мл рекомбинантного белка OprF-aTox-OprI. Для детекции OprF-aTox-OprI апробированы 55 вариантов пар моноклональных антител, в 11 случаях показана способность выявлять рекомбинантный белок. Критерием отбора наиболее чувствительных и специфичных вариантов ИФА служил предел количественного обнаружения. Для всех 11 вариантов теста посчитан предел количественного обнаружения. В результате проведенных исследований были выбраны два варианта иммуноферментного анализа для контроля качества гибридного рекомбинантного белка, обладающие наибольшей чувствительностью. Первый вариант включал в себя пару моноклональных антител, специфичных к эпитопам OprF и OprI, второй вариант — к эпитопам аТох и OprI. Пределы количественного обнаружения составили 2,9 и 13,6 нг/мл (0,0058 и 0,027% от предполагаемого содержания антигена в вакцине) для первого и второго вариантов ИФА. Отработаны два варианта ИФА для выявления гибридного рекомбинантного белка OprF-aTox-Oprl. Первый вариант позволяет определить количество белка и оценить полноту его сорбции на геле гидроокиси алюминия. Для подтверждения подлинности белка целесообразно применять оба метода, поскольку они позволяют доказать наличие всех трех антигенов (OprF, аТох и OprI), присутствующих в слитом белке.

Авторы:

Издание: Медицинская иммунология
Год издания: 2020
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2020.-N 4.-С.805-810. Библ. 9 назв.
Просмотров: 21