МОДЕЛИРОВАНИЕ МУКОВИСЦИДОЗА В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ НЕК293Т И РАЗРАБОТКА СПОСОБА КОРРЕКЦИИ МУТАЦИИ F508del

Аннотация:

Проводилось изучение возможности моделирования муковисцидоза в клеточной культуре НЕК293Т и коррекция мутации F508del с помощью метода CRISPR/Cas9. Протестированы четыре направляющие РНК в комбинации с тремя нуклеазами Cas9 и двумя матрицами для репарации ДНК. Моделирование муковисцидоза в клеточной культуре НЕК293Т достигали благодаря трансфекции в клетки дополнительной плазмиды pGEM-CFTR, содержащей локус CFTR с мутацией F508del, на которой оценивали эффективность редактирования с помощью глубокого таргетного секвенирования. Эффективность редактирования локуса CFTR составила 5,5%. Частота коррекции мутации варьировала от 0,08% до 0,7% аллелей, в зависимости от используемой комбинации компонентов CRISPR/Cas9. Точность разных комбинаций Cas9/sgRNA варьировала от 61,4% до 90,9%, максимальный показатель зарегистрирован для saCas9/saCFTR#3. В работе продемонстрирована возможность моделирования муковисцидоза в клеточной культуре НЕК293Т с помощью синтетической плазмиды и оценена эффективность коррекции мутации F508del с использованием различных комбинаций CRISPR/Cas9. Муковисцидоз - наследственное моногенное заболевание, возникающее в результате мутаций в гене CFTR. Эти мутации влекут за собой различные нарушения работы канала CFTR, участвующего в транспорте ионов хлора и натрия в эпителиальных клетках. В результате этого развиваются симптомы, в первую очередь связанные с поражением легких и поджелудочной железы. Самой частой мутацией в Европе является утрата фенилаланина в позиции 508 полипептидной цепи CFTR в результате трехнуклеотидной делеции - F508del, частота которой достигает 70%. Проблема разработки этиотропной терапии муковисцидоза остается актуальной и по сей день, даже несмотря на совершенствование патогенетической терапии. Классическая генная терапия (доставка в клетки правильной копии гена CFTR) демонстрирует очень низкую эффективность доставки таргетной молекулы в клетки верхних дыхательных путей, несмотря на хорошие результаты, полученные в доклинических исследованиях. Невозможность доставки гена CFTR приводит к отсутствию или чрезвычайно низкому клиническому эффекту, что не позволяет использовать эти методы в рутинной практике. Целью работы явилось изучение возможности моделирования муковисцидоза в клеточной культуре НЕК293Т и коррекция мутации F508del с помощью метода CRISPR/Cas9.

Авторы:

Издание: Медицинский вестник Северного Кавказа
Год издания: 2020
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2020.-N 2.-С.158-162. Библ. 20 назв.
Просмотров: 25