МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ГЕН РИБОНУКЛЕАЗЫ ОБЕСПЕЧИВАЕТ ЭФФЕКТИВНУЮ ПОЗИТИВНУЮ СЕЛЕКЦИЮ ПРИ МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ

Аннотация:

Предложена новая стратегия позитивной селекции рекомбинантных плазмид, основанная на использовании условно летального гена. Экспрессия в Е. coli гена бактериальной рибонуклеазы - барназы - вызывает гибель клетки-хозяина. Включение в ген барназы чужеродной ДНК приводит к синтезу дефектного, каталитически неактивного белка, который не влияет на жизнеспособность клеток. Таким образом, колонии образуют только клетки, содержащие плазмиды со вставками клонируемой ДНК, в то время как клетки, в которые попал не расщепленный рестриктазой вектор, или произошло восстановление гена рибонуклеазы в результате дотирования и другие события, приводящие к появлению "фона", погибают. Предложенный принцип реализован с использованием плазмид, несущих как нативный ген барназы, так и ген, в который без нарушения рамки считывания были введены участки узнавания часто используемых рестриктаз. Компьютерное моделирование пространственной структуры производных барназы со вставками, соответствующими вводимым в ген участкам узнавания рестрикционных эндонуклеаз, позволило предсказать каталитические свойства конструируемых производных барназы и выбрать оптимальный вариант. Получена векторная плазмида рМТ440, содержащая внутри гена барназы вместо кодона Val-36 весь полилинкерный участок pUC19. Вставка 19 дополнительных аминокислотных остатков, соответствующая полилинкерному участку, не влияла на цитотоксичноеть барназы, что подтвердило правильность структурно-функциональных оценок, положенных в основу разрабатываемого подхода.

Авторы:

Издание: Молекулярная биология
Год издания: 2000
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2000.-N 1.-С.48-54
Просмотров: 29