Полный текст
Е.Н. Сазонова1,3, Е.Ю. Самарина1, А.В. Ильиных2, О.А. Сазонов1
Использование метода кислотных эритрограмм для выявления мембранотропного эффекта биологически активных пептидов
1Дальневосточный государственный медицинский университет, 680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел. 8-(4212)-30-53-11, e-mail: nauka@mail.fesmu.ru;
2КГБУЗ "Перинатальный центр" министерства здравоохранения Хабаровского края, 680028, ул. Истомина, 85, тел. 8-(4212)-45-40-03;
3Хабаровский филиал ФГБНУ "Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания" - НИИ охраны материнства и детства, 680022, ул. Воронежская, 49, кор. 1, тел. 8-(4212)-98-05-91, e-mail: iomid@yandex.ru, г. Хабаровск
Контактная информация: Е.Н. Сазонова, e-mail: sazen@mail.ru
Резюме:
Методом кислотных эритрограмм изучали мембранотропное действие биологически активных пептидов (БАП). Инкубация на воздухе суспензии эритроцитов в изотоническом растворе хлорида натрия вызывала снижение их устойчивости к кислотному гемолизу: уменьшалась продолжительность гемолиза, снижалась суммарная стойкость эритроцитов. Инкубация на воздухе суспензии эритроцитов с добавлением растворов БАП (10-8М) изменяла резистентность эритроцитов к гемолитику. Установлено, что БАП: неопиатный аналог лей-энкефалина (НАЛЭ - Phe-D-Ala-Glu-Phe-Leu-Arg), Селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) и Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) увеличивают устойчивость мембран эритроцитов к кислотному гемолизу, а пептид Arg-Gly-Arg-Pro-Gly-Pro повышает скорость гемолиза. Мембранотропное действие определяет неспецифические эффекты БАП и спектр их клинического применения. Кислотные эритрограммы могут использоваться как скрининговый метод отбора БАП с мембранотропными свойствами.
Ключевые слова:
регуляторные пептиды, мембранотропное действие, кислотные эритрограммы
E.N. Sazonova1,3, E.Yu. Samarina1, A.V. Il'inyh2, O.A. Sazonov1
Implementation of the method of acidic erythrograms to reveal the membranotropic effect of biologically active peptides
1Far Eastern state medical university;
2Perinatal Center of ministry of health of Khabarovsk Territory;
3Khabarovsk branch of the Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology of Respiration - Research Institute of Maternity and Childhood Protection, Khabarovsk
Summary:
The method of acidic erythrograms was used to study the membranotropic effect of biologically active peptides (BAP). The air exposure of erythrocyte suspension in isotonic sodium chloride solution caused a decrease in their resistance to acid hemolysis: the time of hemolysis decreased, the integral indicator of erythrocyte resistance decreased too. The air exposure of erythrocyte suspension with the BAP solutions (10-8M) changed the hemolytic resistance of erythrocytes. It was found out that a non-opiate analogue of leu-enkephalin (NALE - Phe-D-Ala-Glu-Phe-Leu-Arg), Selank (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) and Semax (Met-Glu -His-Phe-Pro-Gly-Pro) increase the resistance of erythrocyte membranes to acid hemolysis, and the Arg-Gly-Arg-Pro-Gly-Pro peptide decreases the resistance of erythrocyte membranes to acid hemolysis. Membranotropic action can determine the nonspecific effects of BAP and the range of their clinical use. Acidic erythrograms can be used as a screening method for the selection of BAP with membranotropic effects.
Key words:
regulatory peptides, membranotropic effect, acidic erythrograms
Введение
Биологически активные пептиды (БАП) вызывают широкий спектр эффектов, причем некоторые из них не реализуются через специфические рецепторы плазмолеммы клеток. Было выявлено, что БАП могут оказывать прямое воздействие на компоненты клеточных мембран, благодаря способности образовывать с фосфолипидами комплексы, влияющие на структуры цитоскелета и "текучесть" плазмолеммы [11]. В литературе приводятся сведения о влиянии БАП на функционирование ионных каналов и ионных насосов [16] плазмолеммы за счет прямого мембранотропного действия [7]. Способность некоторых БАП проходить через мембраны обуславливает возможность их проникновения через эндотелий сосудов и гемато-энцефалический барьер [14], что определяет перспективу их клинического применения. Поэтому скрининговые исследования мембранотропности БАП является актуальной научной задачей.
Целью данного исследования было проанализировать возможность использования метода кислотных эритрограмм для выявления прямого мембранотропного действия веществ пептидной природы.
Материалы и методы
В эксперименте изучали влияние ряда БАП на стойкость эритроцитов к кислотному гемолизу. Известно, что состояние мембран эритроцитов напрямую определяет их способность противостоять действию гемолитика.
Исследовали следующие пептиды: неопиатный аналог лей-энкефалина (НАЛЭ) (Phe-D-Ala-Glu-Phe-Leu-Arg); Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro); Селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro); пептиды с условными названиями RP (Arg-Gly-Arg-Pro-Gly-Pro) и PL (Pro-Gly-Pro-Leu).
В опытах использовали кровь, полученную из хвостовой вены 3-месячных крыс-самцов линии Wistar. Устанавливали исходную стандартную концентрацию эритроцитов путем разведения 20 мм3 крови в 10 мл 0,9 % раствора хлорида натрия. Контролем служили свежеприготовленные суспензии эритроцитов (серия - "Контроль"). Окислительное повреждение мембран эритроцитов создавали путем инкубации суспензии эритроцитов в 0,9 % растворе хлорида натрия в течение 4 часов в открытой пробирке (на воздухе) при 37 °С (серия - "Гипероксия"). Для анализа мембранотропного влияния пептидов, их добавляли в концентрации 10-8 М при инкубации суспензии эритроцитов на воздухе в течение 4 часов (серии - "Гипероксия + пептид").
В суспензиях эритроцитов регистрировали кинетику кислотного гемолиза методом кислотных эритрограмм с использованием фотоэлектрического фотометра [2]. Для этого к 2 мл суспензии эритроцитов добавляли 2 мл гемолитика (соляная кислота в 0,004N концентрации, разведенная в 0,9 % растворе хлорида натрия) и анализировали динамику оптической плотности полученной суспензии [6]. Регистрацию показаний прибора производили при длине волны 670 нм каждые 15 секунд. В ходе опыта получали ряд значений оптической плотности, убывающих во времени в соответствии с кинетикой гемолиза. Цифровые значения оптической плотности подвергали математической обработке. Определяли время 50 % гемолиза, длительность гемолиза, интегральный показатель суммарной стойкости эритроцитов [5].
Статистическую обработку результатов исследования проводили с применением программы Statistica 10.0. После проверки нормальности распределения статистических рядов подсчитывали средний показатель, стандартную ошибку среднего показателя. Различия между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и считали статистически достоверными при p<0,05. В каждой серии опытов проводили не менее 10 измерений.
Результаты и обсуждение
Инкубация суспензии эритроцитов на воздухе (серия "Гипероксия") оказывала существенное влияние на параметры гемолиза. Во всех проведенных экспериментах в серии "Гипероксия", по сравнению с серией "Контроль", мы наблюдали укорочение продолжительности гемолиза на 7,5-61,1 %, уменьшение времени 50 % гемолиза на 11,3-66,6 % и снижение суммарной стойкости эритроцитов на 10,6-76,1 % (рис. 1). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о снижении способности мембран эритроцитов, инкубированных на воздухе, противостоять действию слабого раствора соляной кислоты. Согласно литературным данным, инкубация эритроцитов на воздухе увеличивает скорость гемолиза в связи с накоплением в эритроцитах малонового диальдегида [9], усилением генерации активных форм кислорода [15]. Это обусловлено тем, что в организме эритроциты подвергаются воздействию кислорода с максимальным парциальным давлением (напряжением) 100 мм рт. ст., в то время как на воздухе парциальное давление кислорода составляет почти 160 мм рт. ст. Снижение устойчивости эритроцитов к действию гемолитика отмечается и в организме, находившемся в условиях избыточной оксигенации [5]. Таким образом, можно говорить о действии на эритроциты в условиях гипероксии окислительного стресса, повреждающего клеточную мембрану.
Рис. 1. Влияние пептидов НАЛЭ, Семакс и Селанк на показатели резистентности эритроцитов к кислотному гемолизу
Примечание. * - отличия достоверны по отношению к серии "Контроль"; # - отличия достоверны по отношению к серии "Гипероксия".
При добавлении в инкубируемую на воздухе суспензию эритроцитов БАП, нами было отмечено разнонаправленное изменение показателей кинетики гемолиза. Добавление в суспензию эритроцитов пептидов НАЛЭ, Селанк и Семакс привело к увеличению стойкости эритроцитов к гемолизу (рис. 1). Об этом свидетельствует выраженное увеличение длительности гемолиза по сравнению с серией "Гипероксия" (серия "Гипероксия + НАЛЭ" - в 2,9 раза; серия "Гипероксия + Семакс" - в 1,67 раза; серия "Гипероксия + Селанк" - в 2,86 раза). Также мы наблюдали увеличение времени 50 % гемолиза серии "Гипероксия + НАЛЭ" - в 4,6 раза; серия "Гипероксия + Семакс" - в 2,0 раза; серия "Гипероксия + Селанк" - в 4,69 раза. Суммарная стойкость эритроцитов была повышена в серии "Гипероксия + НАЛЭ" - в 6,48 раза; серия "Гипероксия + Семакс" - в 2,59 раза; серия "Гипероксия + Селанк" - в 6,83 раза.
Таким образом, пептиды НАЛЭ, Селанк и Семакс препятствуют изменению свойств мембран эритроцитов в условиях гипероксии, следовательно, проявляют мембранопротективную активность. Описано аналогичное действие пептида Семакс in vivo. В работах М.Г. Голубевой (2010, 2018) показано, что введение пептида Семакс белым крысам в условиях иммобилизационного стресса вызывало повышение устойчивости эритроцитов к осмотическому гемолизу [3, 4].
Мембранопротективные свойства исследованных пептидов в условиях окислительного стресса, могут быть обусловлены их антиоксидантной активностью [1, 8, 10]. Вместе с тем, следует отметить, что при использовании пептидов НАЛЭ и Селанк мы регистрировали повышение стойкости эритроцитарных мембран не только по отношению к серии "Гипероксия", но и по отношению к серии "Контроль": имело место достоверное увеличение показателей суммарной стойкости эритроцитов и времени 50 % гемолиза по сравнению с соответствующими параметрами контрольной суспензии эритроцитов (рис. 1). Этот факт может свидетельствовать о том, что пептиды НАЛЭ и Селанк не только нивелируют повреждающее действие окислительного стресса на эритроцитарные мембраны, но и обладают собственным мембраностабилизирующим действием. Наблюдаемый эффект, вероятно, не опосредуется специфическими рецепторами, поскольку пептиды относятся к разным классификационным группам.
Пептид PL достоверно не изменял показатели кислотного гемолиза эритроцитов после инкубации на воздухе - они оставались сходными показателям серии "Гипероксия".
Пептид RP ослаблял устойчивость эритроцитов к литическому воздействию соляной кислоты (рис. 2). Показатели серии "Гипероксия + RP" были достоверно ниже не только параметров серии "Контроль", но и параметров серии "Гипероксия". Длительность гемолиза в серии "Гипероксия + RP" была на 32,5 % меньше, чем в серии "Контроль" и на 27,0 % меньше, чем в серии "Гипероксия"; время 50 % гемолиза снижено на 48,4 % и на 41,8 %, соответственно; суммарная стойкость эритроцитов - на 46,8 % и на 40,5 %, соответственно. Полученные данные дают основание утверждать о мембранолитическом действии пептида RP. Описана способность мембранотропных пептидов вызывать процесс реорганизации мембраны, что может привести к ее дестабилизации [13].
Таким образом, сравнительный анализ результатов проведенного исследования по влиянию БАП на кислотную резистентность эритроцитов позволяет установить способность одних пептидов (НАЛЭ, Семакс, Селанк) усиливать, а других (пептид RP) ослаблять устойчивость эритроцитов к литическому воздействию гемолитика. Выявленное разнонаправленное влияние пептидов на устойчивость эритроцитов к кислотному гемолизу может быть обусловлено различиями в последовательности аминокислотных остатков в молекуле изучаемых пептидов. В связи с чем, при контакте с мембраной эритроцитов исследуемые пептиды могут оказывать неодинаковое влияние на комплекс липидных и белковых молекул, поддерживающих структурную целостность мембран, и, как следствие, усиливать или ослаблять их исходную резистентность.
В литературе приводятся сведения о пептидах, которые, благодаря структурным особенностям, могут интегрироваться в состав плазмолеммы и даже пенетрировать ее, проходя в цитоплазму. Анализ аминокислотных последовательностей проникающих (cell-penetrating) пептидов не выявляет их гомологии, однако в них почти всегда присутствует аргинин [12]. Мембранотропные пептиды отличаются значительной конформационной гибкостью и способны заякориваться в мембране. Для таких пептидов характерны амфипатические свойства - наличие гидрофобных и гидрофильных фрагментов с присутствием аминокислот аланин, глицин и пролин. Взаимодействие с фосфолипидным бислоем также характерно для аминокислот с ароматическими остатками (фенилаланин, тирозин, триптофан). Важным свойством мембранотропных БАП является внутренняя конформационная "гибкость" молекулы [13]. Именно этими структурными свойствами обладают исследуемые пептиды, что подтверждает возможность их проникновения в мембрану клеток. Такие пептиды могут быть эффективными "карго" для внутриклеточного "введения" лекарственных веществ, транспорта биологически активных веществ через гематоэнцфалический барьер, цитолитическими факторами антимикробного действия.
Выводы
1. Пептиды НАЛЭ, Семакс, Селанк проявляют мембранопротективный эффект - способны повышать стабильность мембран эритроцитов к кислотному гемолизу в условиях гипероксии.
2. Пептид RP (Arg-Gly-Arg-Pro-Gly-Pro) оказывают мембранолитическое действие, ослабляя устойчивость эритроцитов к гемолитику.
3. Метод кислотных эритрограмм может быть использован как простой скриннинговый метод оценки мембранотропности биологически активных пептидов.
Литература
1. Власова И.М., Салецкий А.М. Спектроскопические флуоресцентные методы исследований нейропротекторных свойств препарата семакс при ишемическом инсульте // Альманах клинической медицины. - 2008. - № 17 (1). - С. 45-48.
2. Гительзон И.И., Терсков И.А. Эритрограммы как метод клинического исследования крови. - Красноярск: Издательство Сибирского отделения Академии наук СССР, 1959. - 247 с.
3. Голубева М.Г. Нейропептид семакс изменяет функциональную активность эритроцитов и тромбоцитов при иммобилизационном стрессе // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2010. - № 42 (2). - С. 45-49.
4. Голубева М.Г. Стрессогенные нарушения эритроцитов и их коррекция с помощью регуляторных пептидов // Успехи физиологических наук. - 2018. - № 49 (1). - С. 3-10.
5. Изместьева О.С., Дзиковская ЛА., Жаворонков Л.П. Влияние экспозиции крыс в кислородной атмосфере с умеренным давлением на резистентность эритроцитов к гемолизу // Бюлл. эксперимен. биологии и медицины. - 2020. - № 2. - С. 156-160.
6. Леонова В.Г. Анализ эритроцитарных популяций в онтогенезе человека. - Новосибирск: Наука, 1987. - 241 с.
7. Мураневич С.А. Только ли через рецепторы осуществляется модулирующее действие нейропептидов // Физиолог. журнал им. И.М. Сеченова. - 1993. - № 79 (4). - С. 9-29.
8. Сазонова Е.Н., Лебедько О.А., Денисюк Г.А. и соавт. Цитопротективный эффект неопиатного аналога лей-энкефалина в первичной культуре пульмональных фибробластов в условиях окислительного стресса // Казанский медицинский журнал. - 2019. - № 100 (1). - С. 153-157.
9. Самохвалов В.А., Сметанина М.Д., Мусейкина Н.Ю. Влияние низкой концентрации перекиси водорода на метаболизм клеток крови // Биомедицинская химия. - 2003. - № 49 (2). - С. 122-127.
10. Флейшман М.Ю., Толстенок И.В., Иннокентьев А.А. Влияние пептида "Селанк" на уровень окислительного стресса в головном мозге и тонкой кишке белых крыс на модели черепно-мозговой травмы // Сибирский научный медицинский журнал. - 2019. - № 39 (2). - С. 46-51.
11. Шустанова Т.А., Бондаренко Т.И., Милютина Н.П., Михалева И.И. Особенности регуляции дельта-сон индуцирующим пептидом свободнорадикальных процессов в тканях и мембранах эритроцитов интактных животных и при стрессе // Успехи физиологических наук. - 2003. - № 34 (1). - С. 31-44.
12. Bechara C., Sagan S. Cell-penetrating peptides: 20 years later, where do we stand // FEBS Lett. - 2013. - № 587 (12). - P. 1693-1702. DOI: 10.1016/j.febslet.2013.04.031.
13. Falanga A., Galdiero M., Galdiero S. Membranotropic Cell Penetrating Peptides: The Outstanding Journey // Int J Mol Sci. - 2015. - № 16 (10). - P. 25323-25337. DOI: 10.3390/ijms161025323.
14. Galdiero S., Falanga A., Morelli G., Galdiero M. gH625: a milestone in understanding the many roles of membranotropic peptides // Biochim Biophys Acta. - 2015. - 1848 (1PtA). - P. 16-25. DOI: 10.1016/j.bbamem.2014.10.006.
15. Portier K., Crouzier D., Guichardant M. Effects of high and low inspired fractions of oxygen on horse erythrocyte membrane properties, blood viscosity and muscle oxygenation during anaesthesia // Vet Anaesth Analg. - 2009. - № 36 (4). - P. 287-298.
16. Yamasaki Y., Way E.L. Possible inhibition of Ca++ pump of rat erythrocyte ghosts by opioid k agonists // Life Sci. - 1983. - Vol. 33, № 1. - P. 723-726.
Методом кислотных эритрограмм изучали мембранотропное действие биологически активных пептидов (БАП). Инкубация на воздухе суспензии эритроцитов в изотоническом растворе хлорида натрия вызывала снижение их устойчивости к кислотному гемолизу: уменьшалась продолжительность гемолиза, снижалась суммарная стойкость эритроцитов. Инкубация на воздухе суспензии эритроцитов с добавлением растворов БАП (10-8М) изменяла резистентность эритроцитов к гемолитику. Установлено, что БАП: неопиатный аналог лей-энкефалина (НАЛЭ - Phe-D-Ala-Glu-Phe-Leu-Arg), Селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) и Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) увеличивают устойчивость мембран эритроцитов к кислотному гемолизу, а пептид Arg-Gly-Arg-Pro-Gly-Pro повышает скорость гемолиза. Мембранотропное действие определяет неспецифические эффекты БАП и спектр их клинического применения. Кислотные эритрограммы могут использоваться как скрининговый метод отбора БАП с мембранотропными свойствами.
Добавить в коллекцию