УСИЛЕНИЕ РАСТВОРИМОСТИ И ОДНОСТАДИЙНАЯ ОЧИСТКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ДИМЕРА КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ G2

Аннотация:

Карбоксипептидаза G2 (CPG2) является бактериальным ферментом, который катализирует переход метотрексата в его неактивные формы. Далее эти продукты в присутствии высоких доз метотрексата у пациентов с почечными нарушениями выводятся, минуя почки. В связи с возрастающим спросом на этот фермент важно было упростить процесс его продукции. С этой целью в настоящем исследовании проведена попытка выделить и очистить этот ценный фермент, используя интеин-опосредованную очистку с помощью хитин-связывающей аффинной метки. Таким образом, ген CPG2 из Pseudomonas sp. (штамм RS16) был оптимизирован, синтезирован и клонирован в экспрессионный вектор pTXBl. Впоследствии конструкцию трансформировали в штамм BL21 (DE3) Escherichia coli. Оптимальные условия для его растворимой экспрессии достигались в 2xYT среде, содержащей 1% глюкозу, 0,5 мМ IPTG через 30 ч инкубации при 25 °С. Фермент без интеина экспрессировался в форме инклюзивных телец, что указывает на необходимость интеина для солюбилизации белка. Затем экспрессированный гомодимерный белок очищали до гомогенности с помощью хитиновой аффинной колонки. Для очищенного белка были получены значения Кm и fccat 6,5 мкМ и 4,57 с-1 соответственно. Анализ гель-фильтрации показал, что полученный рекомбинантный белок представляет собой димер с молекуляроной массой 83 kDa. Флуоресцентная спектроскопия и метод спектроскопии кругового дихроизма подтвердили наличие у CPG2 третичной и вторичной структур соответственно. Применение интеин-опосредованной системы обеспечило возможность одностадийной очистки CPG2, открыв путь к использованию карбоксипептидазы G2 в фармацевтике.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2021
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2021.-N 2.-С.228-235. Библ. 30 назв.
Просмотров: 32