Влияние электропорации ДНК конструкциями на дендритные клетки

Аннотация:

На сегодняшний день, трансфекция клеток млекопитающих ДНК или РНК конструкциями является единственным методом доставки запрограммированной информации в ядро клетки. Одним из часто используемых методов трансфекции в работе с дендритными клетками, является электропорация. Суть метода состоит в повышении проницаемости мембраны путем проведения электрического импульса через клетку. В связи с повышенной проницаемостью мембраны повышается шанс попадания ДНК или РНК конструкций внутрь клетки, но при этом снижается выживаемость клетки после воздействия тока на плазматическую мембрану клетки. В исследовании использовали мышей самцов линии С57В1/6 возраста 2-4 месяца. Из бедренной кости мышей выделяли 20 х 106 клеток костного мозга, после клетки культивировали в полной RPMI1640 среды в течение 7 суток. Для генерации дендритных клеток из клеток костного мозга, в культуральную среду добавляли 100 нг/мл rmFlt3-L на 0 день. После 7 дней культивирования, клеточную культуру электропорировали контрольными некодирующими плазмидами р5 (ЕР Р5) или плазмидами pmaxCCR9 (ЕР CCR9), кодирующими мышиный рецептор хемотаксиса CCR9. В качестве контролей выступали, клеточные культуры электропорированные без плазмид (mock ЕР) и культуры клеток без электропорации (nоnе ЕР). Электропорировали 5 х 105 клеток и оставляли на 10 минут. После 10 минут клетки собирались и рассаживались в 24-луночном планшете в 1 мл культуральной среды и кондиционной среды (1:1). Затем добавляли по 50 нг/мл Flt3-L в каждую лунку. На следующий день трансфицированные клетки оценивались с помощью метода проточной цитофлуориметрии и количественной ПЦР. Установлено, что после электропорации в группах mock ЕР, ЕР Р5, ЕР CCR9 относительное количество живых CD 11с+ дендритных клеток было достоверно меньше, чем в nоn ЕР группе. Более того, в группах ЕР Р5 и ЕР CCR9 было достоверно меньше живых CD11с+ дендритных клеток, чем в группе mock ЕР. Экспрессия маркера CD86 было достоверно выше в группах ЕР Р5 и ЕР CCR9, чем в группах поп ЕР и mock ЕР. Экспрессия I-Аb среди cDC2s было достоверно выше в группе ЕР CCR9 по сравнению с группой поп ЕРУ плазмацитоидных дендритных клеток и конвенциональных дендритных клеток 2-го типа, в группах ЕР CCR9, экспрессия CCR9 была достоверно выше, чем в группе nоn ЕР. Таким образом, в данном исследовании продемонстрирована эффективность электропорации, сопровождающаяся снижением выживаемости и созреванием дендритных клеток.

Авторы:

Издание: Медицинская иммунология
Год издания: 2021
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2021.-N 4.-С.653-658. Библ. 14 назв.
Просмотров: 17