Конструирование и функциональный анализ рекомбинантных штаммов Mycolicibacterium smegmatis, несущих гены бациллярных цитохромов CYP106A1 и CYP106A2

Аннотация:

Штамм Mycolicibacterium smegmatis mc2155 использован в качестве организма-хозяина для экспрессии генов чужеродных цитохром Р450-зависимых монооксигеназ. Для этого геном бактерии модифицировали путем внесения делеций в гены kshB и kstD, кодирующие ключевые этапы деструкции стероидного ядра. Сконструировано три набора генетических конструкций, позволяющих гетерологически экспрессировать гены, кодирующие цитохромы Р450: CYP106A1 из Bacillus megaterium DSM319 и CYP106A2 из В. megaterium АТСС13368, — в клетках М. smegmatis mc2155 (AkshBAkstD). Рекомбинантные плазмиды содержали моноцистронные экспрессионные кассеты генов цитохромов (pNS31 и pNS32), трицистронные кассеты генов цитохромов совместно с кДНК-копиями генов адренодоксина и андренодоксинредуктазы коры надпочечников быка (pNS33 и pNS34) или моноцистронные кассеты генов химерных цитохромов, слитых с ДНК-последовательностью, кодирующей редуктазный домен цитохрома CYP116В2 из почвенной бактерии Rhodococcus sp. NCIMB 9784 (pNS35 и pNS36). Полученные с их использованием рекомбинантные штаммы миколицибактерий в ростовых условиях селективно моногидроксилировали андростендион (АД). Структуру продукта идентифицировали методами масс-спектрометрии, 1Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии как 15р-гидроксиандростендион (15Р-ОН-АД). Максимальный уровень продукции 15Р-ОН-АД (17,3±1,5 мг/л) зарегистрирован при использовании рекомбинантного штамма М. smegmatis mc2155 (AkshBAkstD) (pNS32), экспрессирующего одиночный ген сур106А2 из В. megaterium АТСС13368. Показано, что хозяйские белки М. smegmatis mc2155 способны снабжать электронами гетерологичные цитохромы для реализации их гидроксилирующей активности. Результаты имеют приоритетный характер, расширяют представления о гидроксилировании стероидных соединений бактериальными цитохромами CYP106A1/A2 и важны для создания микробных штаммов-продуцентов ценных гидроксистероидов.

Авторы:

Издание: Биотехнология
Год издания: 2021
Объем: 14с.
Дополнительная информация: 2021.-N 6.-С.34-47. Библ. 32 назв.
Просмотров: 21