ПРЕПАРАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО ЦИКЛОФИЛИНА А ЧЕЛОВЕКА

Аннотация:

Данное исследование посвящено разработке метода получения препаративного количества рекомбинантного циклофилина А человека (рчЦфА) из Escherichia coli. С тотальной мРНК Т-клеточной лимфомы человека Jurkat методом ПЦР с обратной транскрипцией амплифицировали полноразмерную кДНК, кодирующую ген ЦфА человека (CYPA). Далее провели оптимизацию нуклеотидной последовательности гена CYPA для обеспечения его высокоэффективной трансляции в Е. coli. Рекомбинантную ДНК CYPA клонировали в вектор рЕТ22b(+) и полученную экспрессионную плазмиду использовали для трансформации бактерий Е. coli штамма BL21(DE3)Gold. Рекомбинантный клон-продуцент Е. coli обеспечивал синтез рчЦфА в растворимом состоянии в цитоплазме бактерий. Эффективность синтеза рчЦфА составляла до 50% суммарного белка клетки, что позволяло получать рчЦфА в количестве до 1 г с литра культуры. Был отработан метод очистки рчЦфА, состоящий из одноэтапной тандемной анионообменной хроматографии на колонках DEAE- и Q-Sepharose. Чистота полученного белка составляла 95% по данным электрофореза (SDS-PAGE), а его контаминация эндотоксином не превышала 0,05 нг на 1 мг белка, что соответствует требованиям Европейской фармакопеи к инъекционным препаратам. Полученный рекомбинантный белок сохранял функциональные свойства нативного ЦфА, такие как изомеразная активность и хемокиновая активность, выявленная по усилению миграции стволовых кроветворных клеток костного мозга мыши in vivo. Полученный штамм Е. coli является суперпродуцентом и может быть использован при проведении масштабных лабораторных исследований рчЦфА, а также для доклинических и клинических испытаний данного белка как лекарственного средства.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2022
Объем: 13с.
Дополнительная информация: 2022.-N 3.-С.387-399. Библ. 33 назв.
Просмотров: 18