Дифференциация подвидов Francisella tularensis методом INDEL-типирования

Аннотация:

Francisella tularensis, этиологический агент туляремии, относится к факультативным внутриклеточным патогенам, вызывающим тяжёлое заболевание у многих видов животных и человека, и является агентом биотерроризма категории А. В настоящее время F. tularensis делится на четыре подвида: F. tularensis subsp. tularensis (nearctica), F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. mediasiatica, F. tularensis subsp novicida, которые различаются по патогенности и географическому распределению. Исторически такое разделение было обусловлено различным ареалом циркуляции штаммов, их отличиями в биохимической активности и патогенностью для разных хозяев. Биохимическое определение подвидов весьма трудоёмко и требует работы с живыми культурами микроорганизма, что и определяет необходимость разработки новых молекулярно-генетических подходов для генотипирования штаммов F tularensis. Целью настоящего исследования является разработка способа дифференциации подвидов и отдельных групп F. tularensis на основе INDEL-типирования. Задачи исследования: создание локальной базы данных нуклеотидных последовательностей штаммов F. tularensis разных подвидов, поиск INDEL-маркеров, значимых для дифференциации подвидов возбудителя туляремии, конструирование праймеров для детекции INDEL-маркеров с помощью ПЦР, оптимизация набора INDEL-маркеров и выяснение филогенетических связей между изученными штаммами. Локальную базу данных нуклеотидных последовательностей штаммов F. tularensis разных подвидов, представленных в базе данных GenBank, создавали с помощью авторского программного обеспечения. Детекцию INDEL-маркеров в геномах штаммов локальной базы данных проводили с помощью программы «GeneExpert». Конструирование праймеров и ПЦР in silico осуществляли при помощи программы «Primer3Plus» и авторской программы «VirtualPCR», кластерный анализ и построение филогенетического дерева — программы «GrapeTree». В результате использование предложенных 5 INDEL-маркеров для генотипирования 29 изученных штаммов разных подвидов из базы данных GenBank позволило обнаружить 9 индивидуальных генотипов с высоким индексом разнообразия (DI = 0,85). Отмечено не только соответствующее разделение подвидов tularensis, holarctica, mediasiatica и novicida по разным кластерам, но и внутривидовое деление на группы штаммов. Дифференциация подвидов F. tularensis подтверждена in vitro на коллекции штаммов разных подвидов музея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института. Заключение. Впервые разработана схема дифференциации подвидов F. tularensis на основе метода INDEL-типирования, позволяющая in vitro без необходимости секвенирования штаммов идентифицировать как подвиды F. tularensis (tularensis, holarctica, mediasiatica и novicida), так и группы штаммов внутри подвидов. Метод защищен патентом. Топология филогенетического дерева INDEL-генотипов штаммов F. tularensis коррелирует со схемами эволюции туляремийного микроба, представленными ранее. Предлагаемый метод может быть применён для комбинированного типирования штаммов F. tularensis совместно с MLVA- или SNP-типированием.

Авторы:

Издание: Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Год издания: 2022
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 2022.-N 2.-С.193-202. Библ. 37 назв.
Просмотров: 19