Методы контроля за пищевой продукцией нового вида, полученной из насекомых: протокол ПЦР-анализа для выявления и идентификации насекомых Hermetia lllucens на основе зонда и праймерной системы HEI-COI

Аннотация:

Разработка в опережающем режиме методов идентификации сырьевого состава пищевой продукции нового вида, полученной из съедобных насекомых, необходима для обеспечения контроля за ее оборотом в рамках выполнения требований действующего законодательства. Цель исследования - разработка и апробация протокола моноплексного ТаgМаn-ПЦР-анализа (метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по технологии TaqMan) для обнаружения и идентификации таксон-специфичной ДНК насекомого Hermetia Illucens в составе продовольственного сырья и пищевой продукции. Материал и методы. Исследования выполнены с использованием образцов, содержащих целевую последовательность ДНК (высушенные цельные личинки Н. Illucens, а также Н. Illucens в форме жмыха и порошкообразного содержимого капсулы), и заведомо не содержащих данную целевую последовательность ДНК (другие виды насекомых, млекопитающие, растения, микроорганизмы, а также многокомпонентные пищевые продукты: мясные, молочные и растительные). Экстракцию и очистку ДНК проводили СТАВ-методами [коммерческие наборы «Сорб-ГМО-Б» (НПК Синтол, Россия) и DNeasy mericon Food Kit (QIAGEN, Германия)]. Для амплификации целевой последовательности - фрагмента митохондриального гена субъединицы I цитохром с-оксидазы - использовали праймеры и зонд: Hei-COI-F (CCTGAGCTGGTATAGTGGGAAC); Hei-COI-R (AATTTGGTCATCTCCAATTAAAGC); Hei-COI-P (FAM-CGAGCCGAATTAGGTCATCCAGG-BHQ-1). Оптимизацию условий ПЦР проводили на амплификаторах CFX96TM Real-Time PCR System (Bio-Rad, США) и Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) путем эмпирического подбора концентраций праймеров и зонда, температурно-временного режима амплификации. В рамках валидации метода оценивали специфичность, предел обнаружения. Результаты и обсуждение. Оптимизированная реакционная смесь содержит 2,5-кратный ПЦР-буфер Б [КСl, TpucHCl (pH 8,8), 6,25 мМ MgCl2], SynTaq ДНК-полимеразу, dNTP, глицерол, Tween 20, праймеры - по 550 нМ, зонд -100 нМ. Температурно-временной профиль реакции: 95°C - 180 с (95°C - 15 с, 57°C - 60 с), 40 циклов. Предел обнаружения метода составил 0,19 нг ДНК Н. Illucens на реакцию. Специфичность праймерной системы и зонда экспериментально подтверждена в исследованиях с ДНК ряда других насекомых, а также животных, растений и микроорганизмов. Заключение. Разработан протокол моноплексного ПЦР-анализа для выявления и идентификации Hermetia Illucens в продовольственном сырье и пищевой продукции. Валидность метода подтверждена лабораторными исследованиями, что позволяет рекомендовать его для использования в рамках надзора за обращением сырья, полученного из Hermetia Illucens.

Авторы:

Издание: Вопросы питания
Год издания: 2023
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2023.-N 1.-С.36-44. Библ. 17 назв.
Просмотров: 18