Получение Bst-полимеразы для диагностики различных инфекций методом петлевой изотермической амплификации

Аннотация:

Большой фрагмент ДНК-полимеразы I из Geobacillus stearothermophilus GIM1.543 (ДНК-полимераза Bst) обладает 5'-3'-ДНК-полимеразной активностью, 5'-3'-вытесняющей активностью и высокой процессивностью. Благодаря этим свойствам ДНК-полимераза Bst используется в петлевой изотермической амплификации (LAMP), которая обеспечивает амплификацию целевой последовательности с высокой специфичностью и применяется для быстрого обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний человека. Цель работы — получение рекомбинантного фермента Bst-полимеразы в бактериальной системе экспрессии и оценка его свойств в условиях LAMP для диагностики инфекционных заболеваний. Материалы и методы. Методами генетической инженерии получали экспрессионные конструкции, несущие ген Bst-полимеразы. Экспрессию белка проводили в различных штаммах клеток Escherichia соli. Для получения очищенных препаратов белка использовали методы металл-хелатной и гель-фильтрационной хроматографии. Оценку каталитических свойств фермента проводили в реакциях петлевой изотермической амплификации в диагностических системах «АмплиСенс® SARS-CoV-2-IT», «АмплиСенс® IAV-IT» и «АмплиСенс® IBV-IT», предназначенных для качественного определения РНК SARS-CoV-2, вируса гриппа A (IAV) и вируса гриппа В (IBV) соответственно. Результаты. Разработанный протокол наработки, выделения и очистки рекомбинантной Bst-полимеразы позволяет получать фермент в бактериальной системе экспрессии на основе клеток Е. соli в растворимой форме с выходом до 20% от собранной клеточной массы. В реакциях LAMP полученный фермент демонстрирует активность, сопоставимую с коммерческим ферментом Bst 2.0 («NEB»). Заключение. Полученная рекомбинантная Bst-полимераза, учитывая быстрый способ очистки и получения фермента, пригодна для применения в диагностических наборах на основе LAMP.

Авторы:

Издание: Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Год издания: 2023
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2023.-N 3.-С.210-218. Библ. 21 назв.
Просмотров: 17