АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМОЗИНА СИБИРСКОЙ КОСУЛИ (Capreolus pygargus), ПОЛУЧЕННОГО В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ (СНО-К1)

Аннотация:

Впервые установлена структура гена химозина (Хн) сибирской косули (Capreolus pygargus) и определена его экзон/интронная организация. Методом Golden Gate реконструирована и получена в виде ДНК-клона кодирующая часть гена Хн С. pygargus. Сравнительный анализ последовательностей прохимозинов (ПроХн) косули, коровы и одногорбого верблюда выявил ряд аминокислотных замен на участках, формирующих субстрат-связываюшую полость фермента и затрагивающих субсайты специфичности S4 и S1' + S3'. С использованием интеграционного вектора р!Р1 сконструирована рекомбинантная плазмида pIPl-Сар для экспрессии гена ПроХн косули в клетках СНО-К1. Получен поликлон клеток CHO-Kl-CYM-Cap, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного ПроХн в культуральную жидкость. В результате активации зимогена получен препарат рекомбинантного Хн косули с общей молокосвёртывающей активностью 468,4 ± 11,1 lMCU/мл (IMCU-International Milk Clotting Units, международные единицы молокосвертывающей активности). Выход рекомбинантного Хн косули составил 500 мг/л или ~ 468 000 IMCU/л, что превышает показатели выхода генно-инженерных Хн в большинстве используемых систем экспрессии. Основные биохимические свойства полученного фермента сравнивали с коммерческими препаратами рекомбинантных Хн одногорбого верблюда (Camelus dromedarius) и коровы (Bos taurus). Удельная молокосвёртывающая активность рекомбинантного Хн С. pygargus составила 938 ± 22 IMCU/мг белка и была сопоставима с показателями ферментов сравнения. Неспецифическая протеолитическая активность рекомбинантного Хн косули оказалась в 1,4—4,5 раза выше, чем у ферментов коровы и верблюда. По коагуляционной специфичности рекомбинантный Хн С. pygargus занимал промежуточное положение между генно-инженерными аналогами Хн В. taurus и С. dromedarius. Порог термостабильности рекомбинантного Хн косули был равен 55 °C. При 60 °C фермент сохранял < 1% от исходной молокосвёртывающей активности, а его полная термоинактивация наблюдалась при 65 °C.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2023
Объем: 14с.
Дополнительная информация: 2023.-N 9.-С.1556-1569. Библ. 43 назв.
Просмотров: 14