ВЛИЯНИЕ РАСПОЛОЖЕНИЯ И ОРИЕНТАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТОКСИН-АНТИТОКСИНОВОГО ЭЛЕМЕНТА hok/sok НА УРОВЕНЬ БИОСИНТЕЗА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ БЕЛКОВ В БАКТЕРИАЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ЭКСПРЕССИИ

Аннотация:

Генетический токсин-антитоксиновый элемент hok/sok из плазмиды R1 Escherichia coli обеспечивает сегрегационную стабильность плазмид. Бактериальные клетки, потерявшие все копии плазмиды, кодирующей короткоживущий антитоксин, гибнут под действием долгоживущего токсина. Элемент hok/sok в составе векторных плазмид для бактериальной экспрессии может увеличивать продуктивное время биосинтеза рекомбинантных белков, замедляя накопление в популяции непродуцируюших клеток, лишенных целевой плазмиды. В настоящей работе были исследованы различные варианты расположения и ориентации элемента hok/sok в составе стандартной плазмиды рЕТ28а с индуцибельным промотором Т71ас и геном устойчивости к канамицину. Было обнаружено, что элемент hok/sok сохраняет функциональную активность вне зависимости от расположения на плазмиде и ориентации, бактериальные клетки сохраняли плазмиды с hok/sok после 4-х дней культивирования без антибиотика и теряли контрольную плазмиду без данного элемента. На примере трех целевых белков — аспаргиназы Е. coli тип II, гормона роста человека и нуклеопротеина вируса SARS-CoV-2 было продемонстрировано, что для цитоплазматических целевых белков максимальная продуктивность бактерий сохраняется только при расположении элемента hok/sok на плазмиде выше промотора целевого гена. В случае периплазматической локализации белка продуктивность бактерий уменьшается для всех вариантов расположения hok/sok при культивировании с антибиотиком, а при периодическом культивировании бактерий без антибиотика продуктивность лучше сохраняется также при расположении элемента hok/sok выше промотора целевого гена. Данный вариант векторной плазмиды pEHU позволяет увеличить биосинтез нерастворимого в цитоплазме бактерий гормона роста человека более, чем в 2 раза при культивировании бактерий без антибиотика, а также поддерживать биосинтез аспарагиназы при периодическом культивировании без антибиотика в течение 4-х дней на уровне не менее 10 мг/литр. Разработанный сегрегационно стабилизированный плазмидный вектор может быть использован для получения в клетках Е. coli различных рекомбинантных белков без применения антибиотиков.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2023
Объем: 14с.
Дополнительная информация: 2023.-N 9.-С.1606-1619. Библ. 33 назв.
Просмотров: 17