ТРАНСГЕННЫЕ ЛИНИИ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ICGiO22-A-6 И ICGiO22-A-7 C ДОКСИЦИКЛИН-УПРАВЛЯЕМЫМИ ВАРИАНТАМИ ПРОГРАММИРУЕМОЙ НУКЛЕАЗЫ AsCasl2a

Аннотация:

Редактирование геномов плюрипотентных стволовых клеток человека с применением программируемых нуклеаз позволяет создавать модели наследственных патологий с помощью направленного трансгенеза, нокаута генов и замены отдельных нуклеотидов в последовательностяхДНК. C использованием CRISPR/SpCas9-опосредованной гомологичной рекомбинации в локусе AAVS1 были получены клоны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека ICGiO22-A (Malakhova et al., 2020), которые несут трансгены двух вариантов нуклеазы AsCasl2a (также известной как AsCp?), распознающих разные консенсусы PAM (ICGi022-A-6 (AsCasl2a, PAM 5'-TTTV-3') и ICGiO22-A-7 (AsCasl2a, PAM 5'-TYCV-3')), и трансген обратного доксициклин-зависимого трансактиватора M2rtTA. C помощью Вестерн-блот анализа было показано, что добавление в культуральную среду доксициклина вызывает активацию экспрессии белков AsCasl2a(TTTV) и AsCasl2a(TYCV). Полученные трансгенные клоны ИПСК были подвергнуты молекулярно-генетическому и цитогенетическому анализу. C помощью количественной ПЦР и иммуноцитохимического анализа было показано, что в них наблюдается высокий уровень экспрессии мРНК генов-маркеров плюрипотентных клеток — OCT4, NANOG и SOX2, а также специфичная экспрессия белков-маркеров — OCT4, SOX2, SSEA-4 и TRA-l-60. Кроме того, с помощью метода спонтанной дифференцировки ИПСК в эм-бриоидных тельцах, было установлено, что трансгенные клоны могут давать производные всех трех примитивных зародышевыхлистков: эктодермы, мезодермы и энтодермы. Цитогенетический анализ показал, что трансгенные клоны ИПСК имеют нормальный кариотип 46,XX.

Авторы:

Издание: Онтогенез
Год издания: 2023
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 2023.-N 6.-С.405-414. Библ. 15 назв.
Просмотров: 10