Полный текст
Ольга Вячеславовна Шевченко1, Наталья Геннадьевна Плехова2
Фототоксическое действие молекулярного конъюгата на основе хлорина Е6
1,2Тихоокеанский государственный медицинский университет, Владивосток, Россия
1tarakovaolga@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-3113-3995
2pl_nat@hotmail.com, https://orcid.org/0000-0002-8701-7213
Аннотация:
Проведено исследование фотодинамического потенциала соединения, содержащего природный фотосенсибилизатор (ФС) порфиринового ряда Хлорин Е6 и редкоземельный металл европий (полиэтиленимин/Хлорин Е6/диэтилентриаминпентауксусная кислота/фолиевая кислота/европий, PEI/e6/DTPA/FA/Eu). Спектрофотометрическим способом подтвержден состав молекулярного конъюгата, содержащего ФС. Показано, что при воздействии полупроводниковым лазером красного света (λ=645 нм) в течение 20 мин. молекулярный конъюгат в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) способен продуцировать активные формы кислорода (АФК). После 1 сут. контакта с 1,56 мкг/мл молекулярного конъюгата и культурой асцитной аденокарциномы Эрлиха количество некротизированных клеток составляло 78,0±3,9 %, что указывало на его цитотоксическое действие. Наибольший фототоксический эффект PEI/e6/DTPA/FA/Eu проявлялся через 4 сут. После контакта клеток с 12,5 мкг/мл PEI/e6/DTPA/FA/Eu и облучения процент нежизнеспособных составил 81,5±4,1 %, тогда как, для свободного Хлорина Е6 47,4±2,4 %. Полученные результаты являются перспективной основой для дальнейших исследований потенциального фотосенсибилизатора. Для цитирования: Шевченко О.В. Фототоксическое действие молекулярного конъюгата на основе Хлорина Е6 / О.В. Шевченко, Н.Г. Плехова // Дальневосточный медицинский журнал. - 2023. - № 4. - С. 69-73. http://dx.doi.org/10.35177/1994-5191-2023-4-12.
Ключевые слова:
фотосенсибилизатор, Хлорин Е6, европий, молекулярный конъюгат, фототоксичность, клетки аденокарциномы Эрлиха, красный свет, фотодинамическая терапия
Olga V. Shevchenko1, Natalia G. Plekhova2
Phototoxic effect of a new molecular conjugate based on chlorin E6
1,2Pacific State Medical University, Vladivostok, Russia
1tarakovaolga@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-3113-3995
2pl_nat@hotmail.com, https://orcid.org/0000-0002-8701-7213
Abstract:
The photodynamic potential of a compound containing a natural photosensitizer (PS) of the porphyrin series Chlorin e6 and rare earth metal europium (polyethyleneimine/Chlorin e6/diethylenetriaminepentaacetic acid/folic acid/europium, PEI/e6/DTPA/FA/Eu) was studied. Spectrophotometric method confirmed the composition of the molecular conjugate containing PS. It has been shown that due to the expose of a semiconductor laser of red light (λ=645 nm) for 20 min the molecular conjugate in phosphate-buffered saline (PBS) is capable to produce reactive oxygen species (ROS). After 1 day of contact with 1,56 μg/ml of the molecular conjugate and the culture of Ehrlich's ascitic adenocarcinoma the number of necrotic cells was 78,0±3,9 %, indicating its cytotoxic effect. The higher phototoxic effect of PEI/e6/DTPA/FA/Eu was manifested after 4 days. After contact of cells with 12,5 μg/ml PEI/e6/DTPA/FA/Eu and irradiation the percentage of non-viable cells was 81,5±4,1 %, while for free Chlorin e6 it was 47,4±2,4 %. The results obtained are a promising basis for further studies of a potential photosensitizer. For citation: Shevchenko O.V. Phototoxic effect of a new molecular conjugate based on Chlorin E6 / O.V. Shevchenko, N.G. Plekhova // Far Eastern medical journal. - 2023. - № 4. - P. 69-73. http://dx.doi.org/10.35177/1994-5191-2023-4-12.
Key words:
photosensitizer, Chlorin e6, europium, molecular conjugate, phototoxicity, Ehrlich adenocarcinoma cells, red light, photodynamic therapy
Введение
Перспективы применения метода фотодинамической терапии (ФДТ) связаны с неинвазивностью и селективностью в отношении опухолевых клеток. Известные в настоящее время ФС обладают рядом свойств, таких как многоступенчатый дорогостоящий синтез, поэтапная очистка, малая растворимость вещества в биологических жидкостях, нестабильность на свету, которые в целом могут оказывать влияние на финансовые затраты применяемого метода терапии [1]. Одним из направлений исследований в области ФДТ является разработка ФС нового поколения методами модификации физико-химических свойств природных компонентов [2, 3]. Возможным вариантом проведения целенаправленного синтеза является включение тяжелых металлов в структуру ФС для улучшения фотостабильности, фотофизических и фотохимических свойств [4]. Целью настоящего исследования является оценка фототоксического эффекта молекулярного конъюгата на основе фотосенсибилизатора Хлорина Е6 на клетки асцитной аденокарциномы Эрлиха.
Материалы и методы
Определение оптической плотности растворов фотосенсибилизаторов Хлорина Е6 и молекулярного конъюгата полиэтиленимин/Хлорин Е6/диэтилентриаминпентауксусная кислота/фолиевая кислота/европий (PEI/e6/DTPA/FA/Eu) и построение спектра их поглощения в фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) проводили на спектрофлуориметре Synergy H1 (BioTek, США) в диапазоне длин волн 300-700 нм с интервалом 1 нм при температуре 21 °С. Оптимальное время облучения ФС красным светом полупроводникового лазера (ООО "Свет и жизнь", Россия) с λ=645 нм подбирали в диапазоне от 5 до 30 мин. с интервалом в 5 мин. в условиях отсутствия прямого солнечного света в концентрациях от 10 до 50 мкг/мл в ФСБ.
Биологические эффекты молекулярного конъюгата в концентрациях 0,78; 1,56; 3,125; 6,25; 12,5; 25,0; 50,0 мкг/мл оценивали при воздействии на культуру клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха (ААЭ), которую получали путем внутрибрюшинной инокуляции половозрелым самцам мышей ICR линии CD-1, полученных из НПП "Питомник лабораторных животных" (Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова). Манипуляции с животными проводились в соответствии с положениями Хельсинкской декларации, требований Европейской конвенции по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, дизайн исследования одобрен междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 5 от 17.01.2022 г.).
Суспензию клеток разносили в 96-луночные планшеты по 200 мкл в концентрации 1×106 кл/мл в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (Dulbecco's modified Eagles medium, DMEM, Lonza, Verviers, Бельгия), содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (Life Technologics Inc., США) и 0,05 % гентамицина (Sigma Aldrich, США). Подготовленную культуру помещали в инкубировали при 5 % CO2, 37 °C в течение суток, производили замену среды и вносили Хлорин Е6 и PEI/E6/DTPA/FA/Eu в концентрациях 1,56; 3,125; 6,25 и 12,5 мкг/мл и через сутки тестировали на жизнеспособность с помощью метода, позволяющего оценивать способность восстанавливать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид (MTT) в формазан. В каждую лунку планшета с клетками и препаратами вносили по 10 мкл MTT (Merk, США) и инкубировали 4 часа. Далее добавляли по 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, Химреактив, Россия) для разрушения образовавшегося формазана. Оптическую плотность субтратов определяли спектрофотометрически при длине волны 570 нм, используя абсорбцию при λ=800 нм в качестве референса. Поскольку используемые методики основываются на оптических методах, в качестве исследуемых концентраций выбирали диапазон от 0,78 мкг/мл до 50 мкг/мл в целях соблюдения основного закона светопоглощения (закон Бугера-Ламберта-Бера), так как изучаемые ФС представляют собой растворы темно-зеленого цвета.
Фототоксический эффект молекулярного конъюгата PEI/e6/DTPA/FA/Eu в отношении клеток оценивали методом проточной цитометрии после окрашивания 1 мкг/мл 7-Аминоактиномицином Д (7-AAD, Abcam, США). Клетки с Хлорином Е6 и PEI/e6/DTPA/FA/Eu облучали полупроводниковым лазером красного света с λ=645 нм в течение 20 мин. и инкубировали в течение 1 и 4 сут. с последующим окрашиваением [5]. Количество флуоресцирующих клеток с включением зонда 7-AAD оценивали на проточном лазерном цитофлуориметре MACSQuant® Analyzer 10 (Miltenyi Biotech GmbH, Германия) при возбуждении λ=520 нм и 570 нм. Обработку данных проводили, используя программу MACSQualify™ Software v/2/5 (Miltenyi Biotec GmbH, Германия).
Полученные данные обрабатывали с помощью пакета программ Microsoft Exсel 2010, STATISTICA 12.0 (StatSoft Inc., США). Проверка на нормальное распределение количественных показателей выборок проводилась с использованием критериев Шапиро-Уилка и Крамера-Мизеса-Смирнова (ω2). Различия считались достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты и обсуждение
Хлорин Е6 представляет собой светочувствительное соединение порфиринового ряда, выделяемое из сине-зеленых водорослей [6, 7]. На основе Хлорина Е6 получен ряд фотосенсибилизаторов второго поколения, широко применяемых для проведения ФДТ [8, 9, 10]. Особенностью этого ФС является высокий коэффициент поглощения красного света в области 405 и 660 нм, излучаемых медицинскими лазерами [8].
Синтезированный нами раннее [11] молекулярный конъюгат имеет максимумы поглощения в области 403 и 662 нм, характерные для входящего в состав Хлорина Е6 (рис. 1).
Рис. 1. Спектр поглощения Хлорина Е6 и молекулярного конъюгата PEI/E6/DTPA/FA/Eu в концентрации 50 мкг/мл
Примечание. В правом верхнем углу расположено изображение синтезированного молекулярного конъюгата.
Одним из недостатков метода ФДТ является неконтролируемое уменьшение количества ФС ("фотовыгорание") за счет его деградации при дневном свете и в процессе облучения. Молекулы ФС в таком случае повреждаются и теряют способность флуоресцировать, что приводит к уменьшению или полному отсутствию сигнала и их способности излучать энергию. Известно, что изменение величины флуоресценции пропорционально степени окисления молекул зонда активными формами кислорода, что позволяет определить оптимальное время облучения и оценить степень "фотовыгорания" ФС [12].
В рамках настоящего исследования с применением флуорогенного зонда 2',7'-дихлорфлуоресцин диацетата, который под действием АФК окисляется до 2',7'-дихлорфлуоресцеина показано, что наиболее оптимальным временем воздействия красного света с λ=645 нм на синтезируемое соединение является 20 мин (рис. 2).
Процесс облучения светочувствительных соединений неизбежно сопряжен с изменением оптической плотности ФС после воздействия источника излучения. По окончании 30 мин. воздействия на вещества, растворенные в ФСБ, содержание Хлорина Е6 уменьшилось от 183,81±18,83 мкг/мл до 136,27±13,63 мкг/мл, в то время как молекулярного конъюгата от 200,73±20,07 мкг/мл до 154,91±15,49 мкг/мл. Стоит отметить, что наибольшая интенсивность выгорания отмечалась для ФС в концентрации 7 мкг/мл, причем после 30 мин. воздействия красным светом концентрация Хлорина Е6 составляет 3,89±0,19 мкг/мл и 6,11±0,31 мкг/мл для PEI/e6/DTPA/FA/Eu.
Рис. 2. Флуоресценция свободного и конъюгированного 15 мкг/мл Хлорина Е6 в присутствии 4 мкг/мл зонда при облучении красным светом лазера λ=645 нм
Результаты исследования жизнеспособности опухолевых клеток показали, что при концентрации 0,78 мкг/мл PEI/e6/DTPA/FA/Eu через сутки инкубации, количество жизнеспособных составило 80,0±4,0 %, тогда как, при 1,56; 3,125; 6,25 и 12,5 мкг/мл этот процент варьировал от 78,0±3,9 % до 55±2,8 %. При более высоких концентрациях показатель возрастал и составил 78-80 %. Для контрольных интактных клеток без воздействия ФС отмечена 100 % выживаемость клеток.
Исследование цитотоксического эффекта ФС с применением интеркалирующего красителя 7-ААD позволяет идентифицировать клетки с неповрежденными плазматическими мембранами, поскольку не проникает в них. Установлено, что количество нежизнеспособных клеток Эрлиха через 1 сут. после контакта с конъюгатом в минимальной концентрации 1,56 мкг/мл и облучения составило 3,54±0,18 % со свободным Хлорином Е6 22,52±1,13 %. При максимальной концентрации 12,5 мкг/мл ФС через 4 сут. составило 81,49±4,07 % и 47,37±2,37 % соотвественно, что указывало на более мощный цитотоксический потенциал PEI/e6/DTPA/FA/Eu по сравнению с Хлорином Е6.
Таким образом, проведено исследование фотодинамических свойств нового молекулярного конъюгата PEI/e6/DTPA/FA/Eu и его эффективности в качестве потенциального ФС, эффективного в отношении гибели опухолевых клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха.
Выводы
1. Синтезированный молекулярный конъюгат состава PEI/e6/DTPA/FA/Eu имеет в спектре поглощения максимумы в областях 403 и 662 нм, что качественно и количественно подтверждает включение фотосенсибилизатора Хлорина Е6 в структуру вещества.
2. Оптимальным временем воздействия красного света с λ=645 нм на растворы молекулярного конъюгата и Хлорина Е6 является 20 мин. интервал.
3. Установлено, что молекулярный конъюгат PEI/e6/DTPA/FA/Eu в совокупности с 20 мин. облучением красным светом с λ=645 нм облучением обладает более мощным цитотоксическим потенциалом в отношении опухолевых клеток Эрлиха, чем свободный Хлорин Е6.
Список источников
1. Клименко И.В., Лобанов А.В. Биосовместимые супрамолекулярные системы на основе Хлорина Е6 // Актуальные аспекты химической технологии биологически актив-А43. - 2020. - С. 179.
2. Миронычева А.М., Кириллин М.Ю., Хилов А.В., Малыгина А.Ш., Куракина Д.А., Гутаковская В.Н., Гамаюнов С.В. Комбинированное применение двухволнового флуоресцентного мониторинга и бесконтактной термометрии при фотодинамической терапии базальноклеточного рака кожи // Современные технологии в медицине. - 2020. - Т. 12, № 3. - С. 47-54.
3. Мищенко Т.А., Митрошина Е.В., Турубанова В.Д., Альзеибак Р., Балалаева И.В., Ведунова М.В. Сравнительный анализ действия фотосенсибилизаторов фотосенс, фотодитазин и гиперицин на клетки глиомы и первичные нейрональные культуры in vitro // Современные технологии в медицине. - 2019. - Т. 11, № 4. - С. 52-63.
4. Amirshaghaghi A., Yan L., Miller J., Daniel Y., Stein J.M., Busch T.M., Tsourkas A. Chlorin e6-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticle (SPION) nanoclusters as a theranostic agent for dual-mode imaging and photodynamic therapy // Scientific reports. - 2019. - Т. 9, № 1. - P. 2613. doi.org/10.1038/s41598-019-39036-1.
5. Dymek M., Sikora E. Liposomes as biocompatible and smart delivery systems - The current state // Advances in Colloid and Interface Science. - 2022. - P. 102757, doi.org/10.1016/j.cis.2022.102757.
6. Haussmann K., Streitz M., Takvorian A., Grund J., Skenderi Z., Tietze-Bürger C., Bullinger L. Widely applicable, extended flow cytometric stem cell enumeration panel for quality control of advanced cellular products // Scientific Reports. - 2022. - Т. 12, № 1. - P. 17995, doi.org/10.1038/s41598-022-22339-1.
7. Kawasaki R., Ohdake R., Yamana K., Eto T., Sugikawa K., Ikeda A. Photodynamic therapy using self-assembled nanogels comprising chlorin e6-bearing pullulan //Journal of Materials Chemistry B. - 2021. - Т. 9, № 32. - P. 6357-6363, doi.org/10.1039/D1TB00377A.
8. Kubrak T.P., Kołodziej P., Sawicki J., Mazur A., Koziorowska K., Aebisher, D. Some natural photosensitizers and their medicinal properties for use in photodynamic therapy // Molecules. - 2022. - Т. 27, № 4. - P. 1192. doi.org/10.3390/molecules27041192.
9. Nguyen, V. N., Yan, Y., Zhao, J., & Yoon, J. Heavy-atom-free photosensitizers: from molecular design to applications in the photodynamic therapy of cancer // Accounts of chemical research. - 2020. - Т. 54, № 1. - P. 207-220, doi.org/10.1021/acs.accounts.0c00606.
10. Shevchenko O.V., et al. Europium-Containing Conjugate for Photodynamic Therapy of Malignant Neoplasms // Russian Journal of Inorganic Chemistry. - 2022. - Т. 67, № 9. - P. 1361-1367, doi.org/10.1134/S003602362209011X.
11. Shi J., Zeng Q., Wang P., Chang Q., Huang J., Wu M., Wang H. A novel chlorin e6 derivative-mediated photodynamic therapy STBF-PDT reverses photoaging via the TGF-β pathway // Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. - 2023. - Т. 41. - P. 103321, doi.org/10.1016/j.pdpdt.2023.103321.
12. Sztandera K., Gorzkiewicz M., Klajnert-Maculewicz B. Nanocarriers in photodynamic therapy - in vitro and in vivo studies // Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. - 2020. - Т. 12, № 3. - P. e1509, doi.org/10.1007/s11051-023-05701-w.
Проведено исследование фотодинамического потенциала соединения, содержащего природный фотосенсибилизатор (ФС) порфиринового ряда Хлорин Е6 и редкоземельный металл европий (полиэтиленимин/Хлорин Е6/диэтилентриаминпентауксусная кислота/фолиевая кислота/европий, PEI/e6/DTPA/FA/Eu). Спектрофотометрическим способом подтвержден состав молекулярного конъюгата, содержащего ФС. Показано, что при воздействии полупроводниковым лазером красного света (?=645 нм) в течение 20 мин. молекулярный конъюгат в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) способен продуцировать активные формы кислорода (АФК). После 1 сут. контакта с 1,56 мкг/мл молекулярного конъюгата и культурой асцитной аденокарциномы Эрлиха количество некротизированных клеток составляло 78,0±3,9 %, что указывало на его цитотоксическое действие. Наибольший фототоксический эффект PEI/e6/DTPA/FA/Eu проявлялся через 4 сут. После контакта клеток с 12,5 мкг/мл PEI/e6/DTPA/FA/Eu и облучения процент нежизнеспособных составил 81,5±4,1 %, тогда как, для свободного Хлорина Е6 47,4±2,4 %. Полученные результаты являются перспективной основой для дальнейших исследований потенциального фотосенсибилизатора.
Добавить в коллекцию