РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ОЧИСТКИ, БИОХИМИЧЕСКАЯ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО ХИМЕРНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ОЦЕНКИ Т-КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Аннотация:

Диагностика специфического Т-клеточного иммунитета к антигенным детерминантам SARS-CoV-2 у пациентов представляется все более важной задачей ввиду накопления данных о роли Т-клеточного иммунного ответа в протекании коронавирусной инфекции и клиренсе SARS-CoV-2 в случае вторичной инфекции. Ранее нами был разработан рекомбинантный антиген CorD_PS для оценки Т-клеточного противовирусного иммунитета, содержащий консервативные и иммуногенные последовательности структурных белков коронавируса SARS-CoV-2. Был получен его штаммпродуцент Е. coli CorD_PS со стабильной экспрессией рекомбинантного антигена CorD PS. Целью настоящей работы является разработка лабораторной технологии получения рекомбинантного антигена CorD_PS, проведение контроля качества полученного химерного белка и изучение его иммунологической активности. Отработку условий культивирования клеток Е. coli CorD PS проводили в конических колбах в среде LB-M_Km при 37 °C, затем масштабировали в ферментере объемом 30 л. Экспрессию индуцировали добавлением ИПТГ. Контроль экспрессии осуществляли в лизатах культур в 12% ПААГ в денатурирующих условиях. Полученную биомассу лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора с последующим центрифугированием. Были подобраны составы лизирующего и солюбилизирующего буферов, а также условия рефолдинга рекомбинантного белка. Для очистки растворенного белка использовали последовательно катионобменную (SP-сефароза), гидрофобную (Butyl-сефароза) и эксклюзионную (Sephacryl S-200 HR) хроматографии. Белковые примеси в препарате определяли методами обращенно-фазовой ВЭЖХ и электрофореза в 12% ПААГ, остаточные липополисахариды определяли с помощью гель-тромб варианта ЛАЛ-теста, остаточные белки штамма-продуцента — методом иммуноферментного анализа, остаточную ДНК штамма-продуцента — методом связывания с красителем PicoGreen. Контроль специфичности осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа. Оценку продукции цитокинов CD4+T-лимфоцитами в ответ на их стимуляцию рекомбинантным антигеном ex vivo проводили на проточном цитофлуориметре. Выход биомассы при культивировании Е. coli CorDPS в 30 л ферментере составил до 20 г/л за 4 часа индукции 0,1 мМ ИПТГ. Последовательная отмывка телец включения от бактериальных клеточных компонентов и их последующая солюбилизация в буфере, содержащем 8 М мочевину, позволил получить раствор денатурированного антигена с концентрацией 10 мг/мл. Эффективность рефолдинга разведением составила 75%. После трех этапов хроматографической очистки были получены образцы белка с концентрацией 1,2-1,4 мг/мл, чистотой по ВЭЖХ 98,43%, соответствующие ключевым параметрам качества согласно ОФС.1.7.1.0007.15. Рекомбинантный антиген показал специфическое связывание с образцом Первого международного стандарта ВОЗ и образца СОП № 3 aнти-SARS-CoV-2 иммуноглобулинов человека в установленном диапазоне концентраций. CD4+Т-лимфоциты эффективно отвечали на обработку рекомбинантным антигеном увеличением продукции IFNy. Оптимальная концентрация рекомбинантного коронавирусного антигена составила 5 мкг/мл. Разработанный технологический процесс позволяет получать 5-7 грамм антигена коронавирусного рекомбинантного CorD_PS за один цикл культивирования в 30 л ферментационной среды с ключевыми параметрами качества согласно ОФС.1.7.1.0007.15. В результате исследований специфической иммунологической активности рекомбинантного коронавирусного антигена CorD PS была подтверждена концепция возможности его использования в качестве диагностикума для определения формирования Т-клеточного иммунного ответа.

Авторы:

Издание: Медицинская иммунология
Год издания: 2024
Объем: 16с.
Дополнительная информация: 2024.-N 3.-С.591-606. Библ. 28 назв.
Просмотров: 4