КОНСТРУИРОВАНИЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ ИЗОФОРМЫ СИНТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI.

Аннотация:

Сообщается о разработке системы экспрессии индуцибельной изоформы синтазы оксида азота (iNOS) из макрофагов мыши в клетках E.coli. Для этого рамку трансляции iNOS клонировали в экспрессионный вектор pCWori+. Поскольку для биосинтеза активной iNOS необходима коэкспрессия кальмодулина (СаМ), то для получения функциональной экспрессии этого белка была проведена амплификация соответствующего участка библиотеки тотальной кДНК лягушки Xenopus Laevis, после чего сконструированы плазмиды для коэкспрессии кальмодулина под контролем tac и Т7 промоторов. Рекомбинантная iNOS была функционально активна, о чем свидетельствуют результаты анализа СО-восстановленных спектров, детекция образования NO с помощью реакции превращения НЬОз в metHb, а также идентификация молекулы NO методом ЭПР. Выход рекомбинантной iNOS при использовании различных конструкций составил от 10 до 22 мг/л культуральной среды, а удельная активность от 0,42 до 0,64 U/мг белка. Эти цифры совпадают с ранее опубликованными данными других авторов. Установлено, что экспрессированная нами iNOS связана с мембранной фракцией клеток, при этом в супернатанте активность фермента не обнаружена. Данные о мембранной локализации iNOS не укладываются в сложившееся представление о том, что этот фермент является растворимым.

Авторы:

Издание: Вопросы медицинской химии
Год издания: 1999
Объем: 14с.
Дополнительная информация: 1999.-N 5.-С.416-429
Просмотров: 31