ПОДХОД К ПОЛУЧЕНИЮ ЦИКЛИЧЕСКИХ ФОТОРАСЩЕПЛЯЕМЫХ PHК ДЛЯ ФОТОАКТИВИРУЕМОЙ СИСТЕМЫ CRISPR/Cas9

Аннотация:

Создание управляемых систем редактирования генома на основе технологии CRISPRZCas -актуальная задача современной молекулярной биологии и генетической инженерии. Интересный вариант ее решения - модификация направляющих PHK путем введения фоточувствительных групп. Мы разработали подход к получению циклических фоторасщепляемых направляющих CRISPR PHK (crPHK) для системы CRISPR/Cas9, содержащих линкеры на основе 1 -(2-нитрофенил)-1,2-этандиола (PL). B циклизованном состоянии такие направляющие PHK нефункциональны, а при облучении УФ-светом они линеаризуются, индуцируя активацию системы CRISPR/Cas9. Опробованы два химических подхода к образованию циклической PHK на основе реакции Михаэля (тиол-малеимидная конденсация) и медь-катализируемого азид-алкинового циклоприсоединения (реакция “клик”-химии). Для этого получены 5',3'-модифицированные РНК, содержащие соответствующие реакционные группы. Продемонстрировано преимущество реакции азидалкинового циклоприсоединения для получения циклических РНК. Эффективность образования циклических PHK зависит от их вторичной структуры и возможности сближения реакционных групп в пространстве. Получены серии фоторасщепляемых циклических crPHK и их контрольных нерасщепляемых аналогов. Показано, что циклические направляющие crPHK менее эффективно направляют нуклеазу Cas9 для расщепления плазмиды, при этом линеаризация фоторасщепляемых циклических crPHK значительно увеличивает эффективность расщепления плазмиды. Разработанный подход позволяет получать циклические фоторасщепляемые РНК, в том числе направляющие PHK для активации геномного редактирования CRISPR7Cas9 в заданный момент времени в определенном месте. Фоторегуляция геномного редактирования позволит снизить нежелательные нецелевые эффекты и проводить редактирование более прицельно.

Авторы:

Издание: Биоорганическая химия
Год издания: 2024
Объем: 14с.
Дополнительная информация: 2024.-N 5.-С.622-635. Библ. 35 назв.
Просмотров: 3