ПРИМЕНЕНИЕ ОДНОДОМЕННЫХ НАНОТЕЛ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНФОРМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ТРАНСФЕРРИНА МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Аннотация:

Трансферрин (Tf) в плазме крови существует в двух формах: железосодержащей holo-Tf и железо-несодержащей apo-Tf формах. Количественное соотношение этих форм в плазме крови человека - важный биохимический маркер заболеваний, связанных с дефицитом или избытком железа. Применение метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (FPIA) и использование рекомбинантных нанотел верблюда в качестве распознающего реагента для экспрессного определения holo-Tf и apo-Tf позволит разработать быстрые метод определения двух конформаций трансферрина. Синтезированы и охарактеризованы конъюгаты нанотел верблюда aTfl и aTf2 к holo- и аро-формам Tf человека с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Подобраны концентрации конъюгатов FITC-aTfl и FITC-aTf2 (2.5-5 нМ) с оптимальным соотношением сигнал/шум и исследована кинетика связывания FITC-aTfl и FITC-aTf2 с holo- и apo-Tf методом поляризации флуоресценции. Показано, что полное связывание конъюгатов FITC-aTfl и FITC-aTf2 с holo- и apo-Tf наблюдается через 15 и 5 мин инкубации соответственно. Определены равновесные константы диссоциации комплексов FITC-aTfl*holo-Tf и FlTC-aTf2*apo-Tf, которые составили 30.7±0.3 и 15.3±0.2 нМ, соответственно. Продемонстрировано, что инкубация конъюгатов FITC-aTfl и FITC-aTf2 с другими белками человека - лактоферрином, сывороточным альбумином и лизоцимом - не приводит к изменению сигнала поляризации флуоресценции, что свидетельствует о высокой специфичности анализа. Показано, что пары реагентов FITC-aTfl/apo-Tf и FlTC-aTf2/holo-Tf не демонстрировали связывания между собой, что подтверждает аффинность конъюгатов FITC-aTfl и FlTC-aTf2 к holo- и apo-Tf, соответственно. В данной работе показана возможность определения двух форм трансферрина в физиологических жидкостях человека методом FP1 А, которое может иметь диагностическое значение, а применение портативного флуоресцентного анализатора позволит проводить данный анализ вне стен специализированных лабораторий.

Авторы:

Издание: Биоорганическая химия
Год издания: 2025
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 2025.-N 2.-С.280-289. Библ. 44 назв.
Просмотров: 1