МЕТОД МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ИММУНОПРОФИЛИРОВАНИЯ КЛЕТОК КРОВИ МЫШЕЙ С ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ РЕПОРТЁРНОЙ бета-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ LacZ

Аннотация:

Бактериальная бета-галактозидаза (LacZ) широко использовалась в качестве репортёра при создании линий мышей для изучения экспрессии генов. Однако LacZ-репортёры имеют ограничения, связанные с присутствием эндогенной бета-галактозидазы в клетках, а также низкой чувствительностью и проникающей способностью существующих субстратов для обнаружения активности LacZ. Для анализа экспрессии генов методом многоцветной проточной цитометрии в живых клетках требуются точные, чувствительные, нетоксичные флуоресцентные индикаторы. В этом исследовании мы оценили эффективность способного к иммобилизации флуоресцентного зонда SPiDER-бетаGal при детекции LacZ в основных популяциях клеток крови репортёрных мышей методом многоцветной проточной цитометрии. Результаты показали, что SPiDER-бетаGal имел высокую чувствительность к LacZ, однако обнаруживал и эндогенную бета-галактозидазу. Наибольшую фоновую активность имели миелоидные клетки крови. Использование ингибитора протонных помп Бафиломицина А1 позволило повысить точность обнаружения LacZ в популяциях лейкоцитов за счёт подавления эндогенной активности вследствие повышения pH в лизосомах. Продление инкубации с субстратом SPiDER-бетаGal до 60 минут увеличивало чувствительность метода на порядок. Таким образом, применение специфических ингибиторов протонного транспорта в лизосомах позволяет повысить разрешающую способность анализа активности LacZ в клетках крови репортёрных животных, что может быть использовано для мультиканальной сортировки живых лейкоцитов по уровню экспрессии LacZ и поверхностным маркерам для дальнейших функциональных и генетических исследований.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2025
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2025.-N 5.-С.636-644. Библ. 16 назв.
Просмотров: 0