УСКОРЕННАЯ ПРОБОПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ТОЧНОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ПРОТЕОМНОГО АНАЛИЗА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ МЕТОДОМ УЛЬТРАБЫСТРОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Аннотация:

Современные достижения в области жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС1) сделали возможным проведение полнопротеомного количественного анализа за минуты, достигая производительности до 1000 анализов в сутки. В связи с этим актуален пересмотр подходов к пробоподготовке для протеомики, соответственно скорости анализа ВЭЖХ-МС1. Несмотря на существование методов ускоренной пробоподготовки в течение десятилетий, их применение в количественной сверхбыстрой протеомике и комплексное сравнение эффективности до настоящего времени не исследовались. В данной работе проведено сравнение методов ускоренного восстановления, алкилирования и гидролиза белков с помощью ультразвукового, микроволнового излучений и при повышенной температуре. Валидация выполнена с использованием количественного анализа без меток протеомов Saccharomyces cerevisiae, клеточных линий человека и побегов озимой пшеницы методами ВЭЖХ-МС/МС и ВЭЖХ-МС1 без спектров фрагментации (метод DirectMSl). Все эксперименты проводились с использованием коротких хроматографических градиентов от 5 до 16 мин. Для оценки точности количественного анализа использовались количественные стандарты - смеси белков человека и дрожжей. Полученные результаты демонстрируют, что сокращение времени пробоподготовки не влияет на воспроизводимость идентификаций пептидов и белков, несмотря на снижение эффективности восстановления, алкилирования и ферментативного гидролиза белков. Также было обнаружено, что ферментативный гидролиз в течение 30 мин при СВЧ-воздействии и классический 18-часовой гидролиз обеспечили сопоставимую точность количественного анализа при сверхбыстром анализе методом DirectMSl.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2025
Объем: 17с.
Дополнительная информация: 2025.-N 5.-С.656-672. Библ. 61 назв.
Просмотров: 0