Разработка СRISРR/Саs9-опосредованных подходов к перманентному пропуску экзонов при миодистрофии Дюшенна-Беккера

Аннотация:

Миодистрофия Дюшенна-Беккера (МДД) - тяжелое прогрессирующее нервно-мышечное заболевание с дебютом в раннем детском возрасте, что делает разработку эффективных методов терапии критически важной задачей именно в педиатрии. Одним из перспективных подходов является геномное редактирование системой CRISPR/Cas9, направленное на восстановление рамки считывания мутированного гена DMD. Цель. In vitro оценка эффективности двух стратегий СRISРR/Саs9-редактирования для терапии МДД: 1) индукции единичных двуцепочечных разрывов в сайтах сплайсинга для пропуска экзонов 43-55 и 2) индукции двух разрывов в интронах для полного удаления экзонов 11 и 12 с целью восстановления рамки считывания. Проведено экспериментальное исследование in vitro. В качестве мишеней выбраны донорные/ акцепторные сайты сплайсинга экзонов 43-55 гена DMD (для стратегии 1) и последовательности в интронах 10 и 12 (для стратегии 2). Для нуклеаз SpCas9 и SaCas9 методом in silico скрининга были отобраны направляющие РНК (нРНК). Конструкции клонировали в плазмидные векторы. Первичный скрининг нРНК проводили на клеточной линии НЕК293Т. Валидацию проводили на иммортализованных миобластах здорового донора (АВ1190) и пациент-специфичных миобластах с делецией экзонов 48-54 (Р1789). Основными конечными точками были: 1) эффективность редактирования на уровне геномной ДНК, оцениваемая по частоте инделов с помощью секвенирования (TIDE, DECODR, NGS); 2) эффективность пропуска экзонов на уровне мРНК, оцениваемая с помощью таргетного NGS кДНК. В результате для первой стратегии было отобрано 6 высокоэффективных нРНК. Их редактирующая активность на уровне ДНК в миобластах АВ1190 варьировала от 2,8 до 46,05%. Однако ни в миобластах АВ1190, ни в пациент-специ-фичных миобластах Р1789 эти нРНК не привели к детектируемому пропуску целевых экзонов (45, 50, 52, 53, 54, 55) на уровне мРНК. Для второй стратегии две пары нРНК индуцировали протяженные делеции, удаляющие экзоны 11 и 12. Эффективность образования целевой делеции на уровне ДНК для пары на основе SpCas9 составила -20-30% (по данным MLPA). На уровне мРНК в миобластах АВ1190 эффективность пропуска экзонов 11 и 12 составила 12,6% для SpCas9 и 6,0% для SaCas9. Побочными продуктами редактирования стали инверсии и кольцевые молекулы ДНК. Серьезных нежелательных явлений, связанных с редактированием, не зафиксировано. Заключение. Стратегия CRISPR/Cas9, направленная на полное удаление пары экзонов через разрезы в интронах представляет собой эффективный и перспективный подход для коррекции нонсенс-мутаций в этих экзонах. Данный метод потенциально применим для лечения пациентов с МДД, открывая путь к созданию терапии, способной изменить естественное течение заболевания при раннем начале лечения в педиатрической практике.

Авторы:

Издание: Вопросы практической педиатрии
Год издания: 2025
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2025.-N 6.-С.47-55. Библ. 19 назв.
Просмотров: 1