ВЫЯВЛЕНИЕ ОДНОБУКВЕННЫХ ЗАМЕН В АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТАХ ДНК ПУТЕМ ЛИГИРОВАНИЯ ТАНДЕМОВ КОРОТКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В РАСТВОРЕ И НА ТВЕРДОФАЗНОМ НОСИТЕЛЕ

Аннотация:

Предложен метод выявления однобуквенных замен в амплифицированных фрагментах ДНК, основанный на лигировании тандемов коротких олигонуклеотидов. Используя радиоактивно меченые олигонуклеотиды, оценили влияние полимерных носителей - водорастворимого, на основе полиэтиленгликоля (MPEG), и твердофазного, на основе метакрилата (DMEG), присоединенных к октануклеотиду тандема октануклеотид-тетрануклеотид-октануклеотид, - на эффективность и селективность лигирования тандема на 20-звенных ДНК-матрицах в присутствии ДНК-лигазы фага Т4. Введение в октануклеотид остатка полиэтиленгликоля не приводит к уменьшению эффективности лигирования тандема, а иммобилизация октануклеотида на твердофазном носителе DMEG несколько снижает эффективность действия фермента. Иммобилизация лигируемого октануклеотида на полимерном носителе приводит к повышению фактора дискриминации 20-звенных ДНК-матриц с однобуквенными заменами как в сайте связывания тетрануклеотида, так и в сайте связывания октануклеотида, присоединенного к полимеру. С использованием как радиоактивно меченых олигонуклеотидов, так и биотинилированных зондов показано эффективное лигирование тандема коротких олигонуклеотидов в присутствии амплифицированных ДНК-фрагментов. На примере типирования штаммов Ьги и rfBWi-l показана возможность анализа последовательности фрагмента ДНК и достоверного выявления однобуквенных замен в амплификатах ДНК при колориметрическом определении биотинилированного продукта лигирования тандема олигонуклеотидов на твердофазном носителе с помощью конъюгата стрептавидина и щелочной фосфатазы.

Авторы:

Издание: Молекулярная биология
Год издания: 2000
Объем: 14с.
Дополнительная информация: 2000.-N 6.-С.984-997
Просмотров: 31